吡啶-噻唑烷酮杂合分子作为杜氏利什曼原虫增殖潜在抑制剂的设计、合成与生物学评价

《RSC Advances》：Synthesis and biological evaluation of pyridine-based derivatives as potential inhibitors of Leishmania major propagationOpen Access

　　

利什曼病是一种被忽视的热带病，目前可用的治疗方案极为有限且伴随显著的毒性，这凸显了开发具有创新化学结构的新型治疗药物的迫切需求。为填补这一空白，研究人员设计、合成并测试了一系列十四个杂合分子（3a–g 和 5a–g），这些分子将吡啶核心与噻半卡巴腙或噻唑烷酮官能团相结合，并评估了它们对杜氏利什曼原虫（Leishmania major）的体外活性。其中，吡啶-噻唑烷酮杂合体（5a–g）在数值上表现出优于其对应的吡啶-噻半卡巴腙类似物（3a–g）的疗效。值得注意的是，化合物 5e 成为一种有前景的双阶段作用药物，对前鞭毛体（promastigote）形态（IC50 = 8.42 ± 0.14 μM，与参照药物米替福新（miltefosine）的 IC50 = 7.83 μM 相当）和游离无鞭毛体（axenic amastigote）形态（IC50 = 8.88 ± 0.16 μM，同样与米替福新的活性 IC50 = 8.07 μM 相当）均表现出有效性。通过叶酸逆转实验进行的机制探索指向一种抗叶酸作用模式，并提出了建模支持的靶酶 DHFR-TS 和 PTR1。当与叶酸或亚叶酸联合给药时，寄生虫活力以剂量响应方式得以恢复，根据所评估的化合物不同，在 20 μM 和 100 μM 叶酸浓度下的恢复率分别高达 74% 和 83%。此外，5e 在 VERO 细胞中表现出良好的体外细胞毒性特征（CC50 = 393.04 μM；选择性指数 = 46.63）。为进一步深入了解，研究人员进行了分子对接和 100 ns 分子动力学（MD）模拟，以探索 5e 在 PTR1 活性位点内的可能结合相互作用和动态稳定性。这些计算分析支持该化合物对 Lm-PTR1 的推定抑制能力。综上所述，研究结果引入了一类有前景的新型抗利什曼病药物，该类药通过选择性破坏叶酸生物合成途径发挥作用，凸显了其在抗击利什曼病方面的巨大治疗潜力。

论文解读

一、研究背景与意义

利什曼病是一组由超过二十种利什曼原虫属（Leishmania）原虫感染引起的被忽视热带病（Neglected Tropical Diseases, NTDs），全球超过十亿生活在资源匮乏地区的人口受到这些疾病的严重影响。其临床表现主要分为三种类型：皮肤型（以溃疡性皮肤损伤为特征）、黏膜皮肤型（涉及黏膜破坏性病变）以及最严重的内脏型（累及实质器官）。该病的传播循环主要通过受感染雌性白蛉（phlebotomine sandflies）的吸血活动维持。

当前利什曼病的治疗手段极为有限。五价锑制剂（如葡萄糖酸锑钠和葡甲胺锑酸盐）以及两性霉素B脱氧胆酸盐均与显著的全身毒性相关，且需要长期静脉给药，限制了其在资源匮乏环境中的可行性。巴龙霉素临床疗效不稳定，而米替福新（miltefosine）作为地方流行区皮肤利什曼病唯一广泛推荐的口服治疗药物，正面临耐药性出现、显著致畸风险和高成本等日益严峻的挑战。此外，有效疫苗的持续缺失以及多重耐药利什曼原虫菌株的令人担忧的增加，共同构成了严重的治疗危机。因此，开发具有更高疗效、更低不良反应和更短治疗周期的新型抗利什曼病药物已成为紧迫的科学优先事项。

前期研究表明，抑制二氢叶酸还原酶-胸苷酸合酶（dihydrofolate reductase-thymidylate synthase, DHFR-TS）会引发由蝶啶还原酶1（pteridine reductase 1, PTR1）介导的补偿机制，以确保足够的叶酸供应来维持寄生虫存活。这一观察结果表明，有效的抗利什曼病干预应同时靶向DHFR-TS和PTR1。然而，这一观点仍存在争议，因为ptr1基因的缺失已被证明对寄生虫是致死的，这很可能是因为PTR1是负责蝶呤还原的唯一酶，而蝶呤还原过程对寄生虫发育和变体发生至关重要。因此，PTR1被一些研究者视为经过验证的药物靶点。尽管该领域取得了进展，但一个显著的局限性仍然存在：现有研究尚未充分探索耐药寄生虫菌株发展的潜在可能性。

含氮杂环因其显著的生物活性而被广泛认可，对当代药物设计和发现至关重要。其中，六元吡啶环因其在天然产物中的频繁出现而备受关注，包括烟碱等生物碱、烟酸等维生素以及多种辅酶。含有吡啶骨架的化合物因其在药物化学中作为药效团的作用而吸引了广泛的跨学科兴趣。此外，噻半卡巴腙（thiosemicarbazone）因其广泛的生物活性谱而备受关注，特别是其杀利什曼原虫效果。将噻半卡巴腙环化为噻唑烷酮（thiazolidinone）衍生物也被探索为开发抗利什曼病药物的一种可能途径。然而，尽管噻唑烷酮骨架作为可行的抗利什曼病药效团具有相当大的前景，但仅有有限数量的研究报告了具有抗利什曼病潜力的此类衍生物。这种稀缺性强调了扩大抗利什曼病研究化学多样性的必要性，特别是通过将噻唑烷酮部分与具有生物活性的吡啶骨架结合。

二、研究内容与结论

基于上述背景，研究人员采用理性设计方法，以含吡啶部分的FDA批准药物作为结构模板，将该核心骨架与已知具有抗利什曼病特性的碳硫酰胺和噻唑烷酮部分相结合，设计并合成了十四个新型杂合分子（3a–g 和 5a–g），并系统评估了它们对杜氏利什曼原虫（L. major）的体外抗利什曼病活性。

体外生物学评估结果表明，所合成的化合物库对L. major的前鞭毛体和游离无鞭毛体阶段均表现出中度至显著的抗利什曼病功效。3a–g系列对前鞭毛体的IC₅₀值在26.62 ± 0.34至42.82 ± 0.42 μM范围内，而5a–g系列显示出数值上更好的效力，IC₅₀值在8.42 ± 0.14至28.58 ± 0.44 μM范围内。构效关系（SAR）分析表明，噻唑烷酮核心通常比噻半卡巴腙骨架表现出更强的效力；在噻唑烷酮系列中，R位取代通常增强活性，其中含氯取代基的化合物5e效力最高，IC₅₀值为8.42 ± 0.14 μM，比未取代的5a（IC₅₀ = 28.58 ± 0.44 μM）活性提高约3.4倍。相反，在噻半卡巴腙系列中引入氯取代基导致活性显著降低。对游离无鞭毛体阶段的评估显示，3a–g系列的IC₅₀值在27.92 ± 0.32至37.10 ± 0.42 μM范围内，5a–g系列则表现出数值上更好的微摩尔级抑制，IC₅₀值在8.88 ± 0.16至28.98 ± 0.42 μM范围内。化合物5e对无鞭毛体的IC₅₀值为8.88 ± 0.16 μM，接近米替福新的活性，凸显了该分子卓越的双阶段抑制潜力。

为探究化合物5e的作用机制，研究人员进行了叶酸逆转实验。结果表明，5e的抗利什曼病活性可被叶酸和亚叶酸以剂量依赖方式逆转，寄生虫存活率从无竞争物时的28%分别提高到100 μM叶酸和亚叶酸处理下的83%和89%。这一发现支持5e可能通过干扰叶酸依赖性酶（如DHFR和/或PTR1）发挥抗利什曼病作用，提示其具有抗叶酸作用模式。此外，5e在VERO细胞中表现出良好的体外细胞毒性特征，CC₅₀值为393.04 μM，选择性指数（SI）为46.63，表明该化合物对寄生虫相对于哺乳动物细胞具有显著的选择性。

三、关键技术方法

研究人员主要运用了以下关键技术方法开展研究：一是有机合成技术，通过缩合反应和环化反应制备目标化合物，并利用核磁共振波谱（包括¹H-NMR和¹³C-NMR）、高分辨质谱（HR-ESI-MS）和元素分析进行结构表征；二是体外抗利什曼病活性评估，采用基于刃天青（resazurin）的比色法分别测定化合物对前鞭毛体和游离无鞭毛体的半数抑制浓度（IC₅₀）；三是叶酸逆转实验，通过外源性补充叶酸或亚叶酸验证化合物的抗叶酸作用机制；四是VERO细胞毒性评估，采用结晶紫染色法测定半数细胞毒性浓度（CC₅₀）并计算选择性指数；五是计算模拟方法，包括使用ADMETlab 3.0平台预测化合物的ADME性质、利用AutoDock Vina进行分子对接研究化合物与LmPTR1和LmDHFR的结合模式，以及进行100 ns分子动力学（MD）模拟评估蛋白-配体复合物的动态稳定性。

四、研究结果

4.1 体外抗利什曼病活性

研究人员将所有合成的化合物（3a–g和5a–g）对L. major的前鞭毛体和游离无鞭毛体形态进行了体外评估，并与参照药物米替福新进行了比较。结果表明，5a–g系列总体上比3a–g系列表现出更好的数值效力。化合物5e脱颖而出，对前鞭毛体（IC₅₀ = 8.42 ± 0.14 μM）和游离无鞭毛体（IC₅₀ = 8.88 ± 0.16 μM）均表现出与米替福新相当的抑制活性，确立了其作为有效双阶段抗利什曼病药物的地位。构效关系分析揭示了噻唑烷酮核心的环化策略和选择性氯取代对活性的关键促进作用。

4.2 叶酸和亚叶酸对杂合体5e抗利什曼病活性的逆转作用

为验证化合物5e的抗叶酸作用机制，研究人员进行了叶酸逆转实验。结果显示，5e的抗利什曼病活性可被叶酸和亚叶酸以剂量依赖方式逆转。添加100 μM叶酸和亚叶酸分别将寄生虫存活率从28%提高到83%和89%，其逆转程度和动力学与参照DHFR抑制剂甲氧苄啶（trimethoprim）定量相当。这一结果支持5e通过干扰叶酸依赖性酶（如DHFR和/或PTR1）发挥抗利什曼病作用。

4.3 体外细胞毒性评估

研究人员在非洲绿猴肾（VERO）细胞上评估了最活跃化合物5e的体外细胞毒性。结果显示5e的CC₅₀值为393.04 μM，对应抗无鞭毛体IC₅₀为8.88 μM，选择性指数（SI）为44.26，表明该化合物对寄生虫具有显著的选择性毒性。

4.4 ADME特性预测

研究人员使用ADMETlab 3.0平台评估了化合物5e的ADME特性，并与参照药物米替福新进行了比较。5e的分子量（MW）为318.03 g mol^?1，log P为3.06，拓扑极性表面积（TPSA）为57.59 ?²，一个氢键供体（nHD）和五个氢键受体（nHA）。大多数描述符位于预测模型的推荐范围内，与米替福新基本相当。尽管预测的log P值略高于最佳范围，提示亲脂性增加，但其余理化参数符合公认的药物相似性标准。

4.5 化合物5e与LmPTR1和LmDHFR的分子对接

研究人员选择化合物5e进行分子对接研究。在LmPTR1活性位点内，5e与Val230形成一个氢键，与Arg17形成π-阳离子相互作用，与His241形成π-硫相互作用，与Phe113形成π-π堆积，并与Leu188、Met183和NDP302（还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸辅因子）形成疏水接触。在LmDHFR活性位点内，5e与Val156形成氢键，与Phe56形成π-π堆积，与Met53形成π-硫相互作用，并涉及Ala32、Val87和Leu94的多种疏水相互作用。对接评分分别为?7.9和?7.7 kcal mol^?1。

4.6 化合物5e与LmPTR1和LmDHFR复合物的分子动力学模拟

研究人员对5e–LmPTR1和5e–LmDHFR复合物进行了100 ns分子动力学模拟。均方根偏差（RMSD）轨迹达到稳定平台，表明复合物在模拟过程中实现了适当平衡。配体5e在活性位点内的稳定性得到了溶剂可及表面积（SASA）和回旋半径（R_g）一致特征的支持。5e的质心保持在LmPTR1（2.5 ± 0.5 nm）和LmDHFR（3.0 ± 0.5 nm）质心附近，表明整个模拟过程中结合稳定。均方根波动（RMSF）分析显示，两种蛋白的apo形式和配体结合形式之间具有相似的波动模式，进一步支持5e在两个靶标活性位点内的稳定容纳。

五、讨论与结论

研究人员指出，虽然生物测定和分子对接结果支持靶标参与，但未进行酶动力学或机制研究来确定抑制是可逆的、不可逆的、竞争性的、非竞争性的还是变构性的。因此，精确的抑制模式需要通过专门的生化和生物物理研究进一步探究。此外，MD分析的一个局限性是每个复合物仅执行了单一100 ns轨迹，额外的独立重复模拟和更长的采样时间将进一步加强所观察行为的稳健性和可重复性。

综上所述，研究人员制备了十四个杂合分子（3a–g和5a–g），其特点是吡啶骨架与噻半卡巴腙或噻唑烷酮部分相连，并评估了它们的体外抗利什曼病活性。噻唑烷酮衍生物（5a–g）在测试条件下通常显示出比相应噻半卡巴腙衍生物更低的数值IC₅₀值。化合物5e尤为值得注意，对前鞭毛体（IC₅₀ = 8.42 μM）和游离无鞭毛体（IC₅₀ = 8.88 μM）表现出有效的双阶段功效，与米替福新相当。使用叶酸逆转实验的机制研究表明其具有抗叶酸作用模式，并提出了建模支持的靶酶PTR1/DHFR-TS；与叶酸或亚叶酸共同给药以剂量依赖方式恢复寄生虫生长（恢复率高达83%）。此外，5e在哺乳动物VERO细胞中表现出良好的体外细胞毒性特征（CC₅₀ = 393.04 μM，选择性指数 = 44.26）。为合理化解这些发现，研究人员进行了分子对接和100 ns MD模拟，为5e在Lm-PTR1结合口袋内的稳定容纳及其作为有效抗利什曼病药物的潜力提供了计算支持。这些结果引入了一类有前景的新型抗利什曼病药物，通过选择性破坏叶酸生物合成途径发挥作用，凸显了其在抗击利什曼病方面的显著治疗前景。