新型磺酰胺类HDAC抑制剂及凋亡诱导剂的设计、合成、计算机模拟与抗癌活性评价

《RSC Advances》：New sulfonamide derivatives as HDAC inhibitors and apoptosis inducers: design, synthesis, in silico study and anticancer evaluationOpen Access

　　

癌症统计数据显示，需要开展更多研究以对抗这一全球性致死疾病。为开发有效抗癌骨架，研究人员设计并合成了新型磺酰胺衍生物，用于潜在抑制组蛋白去乙酰化酶（HDAC）。这些新衍生物对三种癌细胞系显示抗增殖活性：HepG-2（肝癌）、A549（肺癌）和MCF-7（乳腺癌）。对新型衍生物最敏感的癌细胞系为MCF-7，其次为A549，再次为HepG-2。化合物10成为最有效候选物，尤其对MCF-7，其IC₅₀为13.56 ± 1.36 μM；同时，其对A549和HepG-2的IC₅₀分别为20.03 ± 2.17 μM和34.71 ± 4.62 μM。值得注意的是，分子10对受试癌细胞系的体外选择性明显高于参比药物5-氟尿嘧啶（5-FU），对MCF-7、A549和HepG-2的选择性指数（SI）分别为8.74 ± 0.88、5.92 ± 0.74和3.41 ± 0.39，而5-FU分别为1.59 ± 0.13、1.16 ± 0.09和1.67 ± 0.14。这些发现表明，相对于正常WI-38细胞系，化合物10对受试癌细胞具有更大体外选择性；然而，不应将其解释为与5-FU相比总体安全性更优的证据。此外，10抑制HDAC，尤其是HDAC-2，其IC₅₀为2.27 ± 0.07 μM，而参比分子恩替诺特（entinostat）的IC₅₀为1.21 ± 0.04 μM。Annexin V-FITC/PI（膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶）检测表明，凋亡是化合物10所致细胞死亡的主要方式。相对于未处理对照细胞，化合物10使MCF-7总凋亡细胞数增加约15倍。同时，化合物10提高MCF-7细胞中凋亡标志物p53（肿瘤蛋白p53）的表达水平以及半胱天冬酶-9（caspase-9）的蛋白水平，而降低B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）和血管内皮生长因子（VEGF）的表达水平。对接数据揭示化合物10与HDAC-2的结合模式，并与生物学数据一致。最后，本研究提示化合物10可作为先导分子，用于进一步优化为新型抗癌药物。

研究背景与问题：癌症仍是全球严重健康威胁，尽管治疗取得进展，仍需开发有效抗癌骨架。HDAC（组蛋白去乙酰化酶）通过去除组蛋白赖氨酸乙酰基调节染色质结构和转录；HDAC在癌细胞中常过表达，参与癌症生长和转移，并促进血管生成和逃逸凋亡。约18个HDAC亚型分为四类；I类包括Zn依赖的HDAC1、2、3和8，与癌症生长高度相关，在乳腺癌和结肠癌等中已证实过表达，因此被视为相对安全有效的抗癌靶点；抑制I类HDAC可抑制癌症生长、减少血管生成并诱导细胞周期阻滞和细胞死亡。现有经FDA完全批准的HDAC抑制剂仅vorinostat和belinostat，二者均为羟肟酸衍生物；尚无苯甲酰胺衍生物获FDA完全批准。HDAC抑制剂分为羟肟酸衍生物、苯甲酰胺、环肽和短链脂肪酸四类；前两类主要抑制I类HDAC，羟肟酸衍生物的作用还延伸至II类和IV类，并具有Zn结合基团、疏水连接基、极性连接基和CAP（帽端）等共同药效团。为此，研究人员基于药效团和分子杂合设计新型I类HDAC抑制剂：以氨磺酰基（sulfamoyl）作为Zn结合基团（据作者所知，此前未见HDAC抑制剂采用该基团），以苯环为疏水连接基，以氨基乙酰胺（aminoacetamide）为极性连接基，以取代苯环为CAP，并考察取代基影响。研究人员设计合成化合物8–11并开展抗癌评价；结论是化合物10为最有前景先导，尤其对MCF-7，其体外选择性高于5-FU（5-氟尿嘧啶），并可抑制HDAC-2、诱导凋亡；意义在于为未来发现新型HDAC抑制剂提供磺酰胺骨架。

关键技术方法：研究经氯乙酰化后再与不同芳香胺反应合成8–11；采用MTT法在HepG-2、A549、MCF-7及正常WI-38细胞系评价抗增殖和选择性；用PI（碘化丙啶）、AO/EB（吖啶橙/溴化乙锭）染色及Annexin V-FITC/PI检测细胞死亡和凋亡；用荧光HDAC抑制剂筛选试剂盒测HDAC-1和HDAC-2抑制；用qPCR（实时定量聚合酶链反应）测p53、Bcl-2、VEGF，用ELISA（酶联免疫吸附测定）测caspase-9、IL-6（白细胞介素-6）；用划痕愈合实验测迁移；对HDAC-2（PDB ID: 4LXZ）进行分子对接，重对接RMSD（均方根偏差）为1.3 ?；采用ANOVA（方差分析）统计。

研究结果：2.1 Chemistry（化学）：通过合成反应制得目标磺酰胺衍生物8–11，并以波谱和元素分析进行结构确认。2.2.1 Antiproliferative assay and selectivity profiles（抗增殖与选择性）：MTT法显示所有化合物呈剂量依赖细胞毒作用；MCF-7最敏感，其次A549、HepG-2；化合物10最强，对MCF-7、A549、HepG-2的IC₅₀分别为13.56 ± 1.36、20.03 ± 2.17、34.71 ± 4.62 μM，SI分别为8.74 ± 0.88、5.92 ± 0.74、3.41 ± 0.39，均高于5-FU的SI（1.16–1.67）；9次之，8第三，11最低。2.2.2 Structure–activity relationships（SAR，构效关系）：对位取代优于间位；对位氯（10）对肺癌和乳腺癌最有效，作者认为可能与其疏水性有关；对位羟基（9）对肝癌SI最高，但10在HepG-2的IC₅₀更低；对位溴（11）因位阻使活性明显下降。2.2.3 Cell death analysis（细胞死亡分析）：形态学观察显示8–11和5-FU处理均出现细胞皱缩、圆化、单层密度丢失和核浓缩；PI染色显示10剂量依赖膜完整性丧失，AO/EB染色显示浓度依赖的早期、晚期及终末期凋亡。2.2.4 In vitro assay of HDAC-1 and HDAC-2 inhibition（HDAC-1/2抑制）：无细胞荧光法显示10对HDAC-1的IC₅₀为5.66 ± 0.19 μM，对HDAC-2为2.27 ± 0.07 μM；对照entinostat分别为1.04 ± 0.04和1.21 ± 0.04 μM，说明10对HDAC-2亲和更强但效力低于对照。2.2.5 Anti-migration activity（抗迁移）：划痕实验显示10浓度依赖抑制MCF-7迁移，48 h伤口闭合率由76.59%降至49.52%、31.16%、14.15%（3、7、15 μM），迁移率由3.91%/h降至2.53、1.59、0.72%/h。2.2.6 Annexin V-FITC apoptosis assay（凋亡检测）：10处理MCF-7后总凋亡由1.61%升至23.57%（约14.64倍），早期凋亡由1.61%升至23.08%，晚期凋亡由0升至0.49%，坏死由0.14%升至0.55%，提示以凋亡为主而非坏死。2.2.7 Gene expression and protein-level analyses（基因与蛋白分析）：qPCR/ELISA显示10使Bcl-2降低3.23倍、p53升高8.14倍（较对照）及2.51倍（较5-FU）、VEGF降低1.37倍；caspase-9由3.31升至8.40 ng mL^?1（2.54倍）；IL-6由58.69升至87.05 pg mL^?1（1.48倍），而5-FU降低IL-6；作者认为IL-6升高可能反映治疗诱导的细胞应激或炎症反应，但p53升高、caspase-9升高和Bcl-2降低总体符合凋亡诱导。2.3 Docking study（对接研究）：对接HDAC-2（4LXZ）显示新衍生物结合模式类似vorinostat；10的磺酰胺与Zn及His145、His146、Tyr308形成氢键，并与Asp181形成额外氢键；极性连接基与Asp104形成关键氢键，并与Phe155有π–π、Leu276有π–烷基、His145/His146/Tyr308有π–硫相互作用；结合能降序为10>8>11>9，分别为?4.80、?4.33、?4.17、?4.02 kcal mol^?1，但vorinostat（?6.68）更优，对接结果与生物数据一致。

讨论总结：SAR、HDAC抑制、凋亡、迁移、基因表达和对接结果共同支持10为最有前景先导；其HDAC-2抑制为中等强度，体外选择性优于5-FU；IL-6升高需结合整体促凋亡谱解释；局限为未进行组蛋白乙酰化、细胞周期、细胞靶点结合、亚型及碳酸酐酶选择性以及体内疗效评价。研究结论翻译：基于体外生物学结果，本研究提示化合物10作为HDAC抑制剂是先导骨架，值得进一步优化为抗癌剂；建议利用该磺酰胺骨架在未来发现新型HDAC抑制剂。对接数据揭示磺酰胺不仅能结合Zn离子，还能与HDAC-2口袋中的关键氨基酸产生多种有效相互作用。生物学上，该骨架分子显示有前景的抗增殖活性，尤其化合物10；与5-FU相比，10对受试癌细胞相对正常WI-38细胞显示更大体外选择性；此外，它伴随凋亡（Annexin V-FITC/PI）及凋亡相关标志物水平改变；它在无细胞试验中抑制HDAC-2，并在对接模型中显示合理结合模式。局限是未进行组蛋白乙酰化和细胞周期分析等补充机制研究；细胞靶点结合、亚型及碳酸酐酶选择性和体内疗效仍待评价。