9-蒽-苯基-乙烯基-喹啉分子转子：大斯托克斯位移与溶剂化荧光变色用于脂滴成像

《RSC Advances》：Anthracene–phenyl-vinyl–quinoline: a molecular rotor with a large Stokes shift and solvatofluorochromism for lipid-droplet imagingOpen Access

　　

研究人员合成并表征了一种π扩展分子转子9-蒽-苯基-乙烯基-喹啉（9-Anthracene–phenyl-vinyl–quinoline, 9-AnPhVQ）。该化合物表现出极大的斯托克斯位移（12?200 cm^?1）和优异的溶剂化荧光变色（从正己烷到二甲基亚砜的发射位移为156 nm）。研究人员通过在不同摩尔百分比胆固醇的POPC（1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱）膜中进行荧光各向异性测量，研究了其源于分子内旋转受限（restricted intramolecular rotation, RIR）的粘度响应荧光。此外，该探针表现出优先的脂滴成像能力以及铁死亡相关细胞应激响应。这些独特特性确立了9-AnPhVQ作为用于荧光传感和脂滴成像的有前景的分子转子探针。

该研究围绕有机荧光团在生物成像中的应用展开。有机荧光团的结构可调性在光电、荧光生物成像和传感等领域具有重要价值，其中π共轭供体–受体框架被认为是构建基于分子内电荷转移（intramolecular charge transfer, ICT）荧光团的有效策略，这类荧光团可同时具备大斯托克斯位移、粘度响应和明显溶剂化荧光变色特性。蒽因其刚性芳环骨架、环境敏感荧光和可调光电性质而成为有吸引力的分子骨架。然而，与含羰基受体的蒽醌类衍生物不同，非醌型蒽荧光团通常表现出较弱的ICT和有限的溶剂化显色，因此开发兼具显著溶剂化荧光变色和高环境敏感性的蒽基荧光团仍是荧光探针设计的重要挑战。另一方面，微粘度是调控膜流动性、细胞内转运、酶活性和信号转导的关键生理参数，荧光方法因灵敏度高、响应快且适用于活细胞成像，成为局部粘度测量的理想手段。脂滴（lipid droplets, LDs）是参与脂质代谢、能量稳态和细胞信号传导的动态细胞器，其微环境在铁死亡、凋亡等细胞应激及代谢疾病进程中会发生变化。因此，兼具粘度响应和脂滴靶向能力的荧光探针对可视化细胞应激具有重要意义。基于上述背景，研究人员设计并合成了一种π扩展蒽基分子转子9-蒽-苯基-乙烯基-喹啉（9-Anthracene–phenyl-vinyl–quinoline, 9-AnPhVQ），旨在将大斯托克斯位移、溶剂化荧光变色、粘度响应和脂滴靶向成像集成于单一荧光团。

研究人员通过Pd催化的Suzuki–Miyaura交叉偶联反应合成9-AnPhVQ，产率78%，并利用核磁共振（NMR）、高分辨质谱（HRMS）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）和单晶X射线衍射（SC-XRD）进行结构表征。光谱学方面，记录了不同极性溶剂中的紫外-可见吸收和荧光发射光谱，并通过Lippert–Mataga图分析溶剂化行为；电化学测试采用循环伏安法（CV），结合密度泛函理论（DFT）和含时密度泛函理论（TD-DFT）计算电子结构。粘度传感通过甲醇-甘油混合物中的荧光各向异性实验验证，并进一步用于含不同摩尔百分比（mol%）胆固醇的POPC膜微粘度测定。生物成像实验以HeLa细胞为模型，采用MTT法评估细胞毒性，利用Nile Red和LysoTracker Deep Red进行共定位分析，并以油酸、RSL3、erastin和星形孢菌素（staurosporine, STS）处理细胞，通过共聚焦显微镜观察脂滴生成及细胞应激中的荧光变化。

结果部分的主要发现如下。在9-AnPhVQ的合成与结构方面，单晶X射线衍射确认该化合物属于单斜P2₁/n空间群，分子整体非平面，蒽环与苯环之间二面角为88.74°，苯环与喹啉环之间为51.39°，晶体堆积由C–H?π、C–H?N和π?π相互作用维系。光物理性质方面，9-AnPhVQ在乙腈中吸收峰λ_max为333 nm，摩尔消光系数为18?200 M^?1 cm^?1，发射峰λ_max为560 nm，量子产率为0.36，表观斯托克斯位移达12?200 cm^?1（227 nm）。随着溶剂极性从正己烷变为二甲亚砜（DMSO），发射波长从429 nm红移至585 nm，位移达156 nm（6200 cm^?1），而吸收光谱仅呈现约5–10 nm的微小变化，说明该正溶剂化荧光变色源于极性溶剂对极化ICT激发态的优先稳定化，Lippert–Mataga图呈良好线性关系。电化学方面，循环伏安图显示第一个准可逆还原事件E_1/2为?0.78 V，第二个不可逆还原事件E_pc为?1.59 V，多次扫描中峰电流逐渐增大。能级计算方面，由吸收起始波长求得光学带隙为3.02 eV，结合循环伏安数据得到的LUMO能级及推算的HOMO能级与DFT结果一致。DFT计算显示，HOMO主要定域在富电子的蒽单元，LUMO主要定域在缺电子的苯基-乙烯基-喹啉侧臂，表明强ICT特征；计算所得HOMO–LUMO能隙为3.28 eV，与实验值吻合，TD-DFT模拟光谱也与实验吸收和发射光谱相符。粘度依赖的荧光各向异性方面，荧光强度随甲醇-甘油混合物中甘油含量增加而显著增强，表明分子转子特性；荧光各向异性与粘度呈双曲线关系，可作为微粘度测定的标准曲线。在含不同mol%胆固醇的POPC膜中，各向异性值随胆固醇浓度增加而升高，30 mol%胆固醇使膜微粘度增加约两倍，证明该探针可用于膜微粘度定量。溶剂依赖的荧光寿命方面，9-AnPhVQ在正己烷、二氯甲烷（DCM）和DMSO中的平均荧光寿命分别为2.35 ns、4.75 ns和5.06 ns，随溶剂极性增大而递增，表明极性溶剂稳定了电荷分离激发态并抑制非辐射弛豫；据此预期其在疏水脂滴环境中呈现较短寿命和蓝色荧光，可在DAPI通道进行脂滴成像。细胞内共定位研究方面，MTT实验显示50 μM浓度下细胞存活率大于80%，生物相容性良好。在HeLa细胞中，9-AnPhVQ呈离散点状分布，与Nile Red的Pearson共定位系数（PCC）为0.81，与LysoTracker Deep Red的PCC仅为0.21，证明其优先积累于脂滴而非溶酶体。脂滴生物发生方面，500 μM油酸处理HeLa细胞6小时后，9-AnPhVQ的点状荧光信号和平均荧光强度均显著增强，表明其能灵敏报告油酸诱导的脂滴积累。在细胞应激实验中，RSL3处理的细胞较erastin和STS处理细胞表现出更明显的荧光增强，说明9-AnPhVQ对RSL3诱导的铁死亡响应更为显著。

讨论方面，该论文在各项结果中对机制和应用进行了阐释。9-AnPhVQ中蒽作为电子供体、苯基-乙烯基-喹啉作为电子受体，形成ICT电子结构，这是大斯托克斯位移和显著溶剂化荧光变色的结构基础；粘度响应荧光源于RIR机制，胆固醇通过增加膜有序度提高各向异性，使探针可用于膜微环境定量；溶剂依赖的荧光寿命进一步支持了极性敏感激发态动力学。研究结论可概括为：研究人员报道了π扩展蒽基分子转子9-AnPhVQ，它将明显溶剂化荧光变色、大斯托克斯位移、粘度响应荧光和脂滴靶向能力集中于单一荧光团。结构和计算分析确立了供体–受体电子构型和ICT特征，荧光各向异性实验证实了由RIR引起的粘度响应，细胞实验显示其优先定位于脂滴并在脂滴积累和铁死亡相关细胞应激下荧光增强。这些特性使9-AnPhVQ成为用于荧光传感和脂滴成像的有前景的分子转子探针。