基于丝素蛋白-金纳米颗粒杂化纳米结构的室温稳定可持续电化学平台用于癌症相关miRNA检测

《Sensors and Diagnostics》：A sustainable, room-temperature-stable electrochemical platform based on a hybrid protein–nanoparticle nanoarchitecture for the determination of cancer-associated miRNAsOpen Access

设计结合导电纳米材料与可持续功能性生物聚合物的杂化纳米结构，为先进电化学生物传感提供了有力途径。本文报道了一种纳米工程化传感界面，该界面涉及将可生物降解、生物相容且无毒的蛋白质——丝素蛋白（silk fibroin, SF）与金纳米颗粒（gold nanoparticles, AuNPs）组装到丝网印刷碳电极（screen-printed carbon electrodes, SPCEs）上，用于对肿瘤抑制因子miRNA let-7a进行电化学定量。该杂化传感基质通过SF、AuNPs以及与靶标miRNA完全互补的生物素化DNA捕获探针的共同组装构建而成。红外辅助干燥后经甲醇处理诱导SF形成β-折叠结构，产生一个机械稳定且不溶于水的蛋白质网络，该网络保持了纳米颗粒的分散性和生物分子功能。靶标杂交通过抗DNA/RNA异源双链抗体与辣根过氧化物酶标记的二抗偶联进行检测，借助氢醌氧化还原循环实现酶促电流转导。优化后的平台可实现快速杂交和一步免疫标记，在室温干燥储存条件下表现出长期稳定性。该平台在低纳摩尔范围内实现了对靶标miRNA的灵敏测定，同时具备宽线性范围、高重现性和单核苷酸分辨能力。所开发的传感平台被应用于结直肠癌肿瘤组织中miRNA let-7a的测定，未观察到显著的基质效应。本研究结果凸显了AuNPs-SF纳米结构在增强稳定性和性能方面的关键作用，显示出其在涉及生物素化分子的更广泛亲和性生物检测应用中的潜力。

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研究背景与科学问题

微小核糖核酸（microRNAs, miRNAs）作为转录后水平抑制靶蛋白表达的调控分子，参与细胞发育、分化、增殖、炎症反应、凋亡及代谢等多种功能，并与心血管疾病、神经退行性疾病、自身免疫病及肿瘤发生密切相关。其中，let-7家族成员miRNA let-7a在多种癌症中发挥肿瘤抑制因子的作用，其异常表达与肺癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、宫颈癌及结直肠癌（colorectal cancer, CRC）的进展有关。然而，miRNA let-7a易降解、不同miRNA序列高度相似且在临床样本中浓度极低，使其检测极具挑战性。传统检测方法如Northern印迹杂交灵敏度不足且需使用放射性同位素；微阵列成本高昂且步骤繁琐；逆转录聚合酶链式反应虽灵敏度足够，但引物合成复杂、需要专门仪器且实验流程劳动密集，限制了常规临床应用。近年来涌现的光学和电化学传感平台虽然实现了低检出限，但往往需要复杂的信号放大过程导致分析时间长达2小时，精密度较差，线性范围窄，且多数仅在加标样本中验证。

为解决上述问题，研究人员利用丝素蛋白（silk fibroin, SF）这一可生物降解、生物相容且无毒的蛋白质，将其与金纳米颗粒（gold nanoparticles, AuNPs）结合，开发了一种新型电化学基因传感器（genosensor）。此前，研究人员已成功将SF应用于酶传感器和免疫传感器的开发，但尚未有研究探索SF在金纳米颗粒捕获及基因传感器中的应用。本研究的目的是构建一种基于SF-AuNPs杂化纳米结构的集成化电化学平台，实现对CRC患者组织样本中miRNA let-7a的灵敏、特异且稳定的检测。

主要技术方法

研究人员采用的主要关键技术包括：1）Turkevich法合成直径约20 nm的AuNPs；2）将AuNPs、生物素化DNA捕获探针（b-Cp）与SF溶液混合后滴涂于丝网印刷碳电极（SPCEs）工作电极表面，经红外干燥和甲醇处理诱导SF形成不溶性β-折叠结构，构建b-Cp-AuNPs-SF/SPCE传感界面；3）靶标miRNA let-7a与固定化b-Cp直接杂交形成DNA/RNA异源双链，由抗DNA/RNA异源双链抗体特异性识别，再通过辣根过氧化物酶标记的二抗进行酶促标记；4）在氢醌（hydroquinone, HQ）和过氧化氢（H₂O₂）存在下进行安培检测，施加-0.20 V电位记录催化电流变化。临床样本来自马德里圣卡洛斯临床医院生物样本库的CRC患者配对非肿瘤和肿瘤组织。

研究结果

电极表面工程设计增强辨别能力：研究人员比较了五种不同传感构型（b-Cp+SF、b-Cp+AuNPs、SF+AuNPs、b-Cp+SF+AuNPs以及商用GNP-SPCE修饰SF+b-Cp），发现b-Cp+SF+AuNPs/SPCE构型展现出最高的目标/背景响应比（T/B比），表明SF与AuNPs的协同作用实现了最低的背景电流和最强的杂交信号，而单独使用AuNPs或商业预沉积金电极均无法达到同等效果。

电化学与形貌表征：循环伏安法和电化学阻抗谱表征显示，SF修饰使电荷转移电阻从1.94 kΩ显著增加至42.9 kΩ，加入AuNPs后降至10.9 kΩ，进一步引入b-Cp后降至9.35 kΩ，证实了AuNPs的导电增强作用和b-Cp的有效固定。扫描电子显微镜观察确认了连续SF膜的形成、AuNPs在SF基体中的均匀分布（平均直径23±4 nm）以及b-Cp覆盖后对比度的减弱。

生物平台组装与杂交条件优化：通过对AuNPs尺寸（20 nm最优）、AuNPs体积（10 μL）、SF浓度（2% w/v）、b-Cp浓度（1 μM）、沉积体积（5 μL）、混合方案（直接混合优于预孵育）、封闭策略（无需额外封闭剂）、杂交时间（30 min）、标记方案（一步法优于两步法）、抗体浓度（抗DNA/RNA抗体1 μg mL^-1，HRP二抗1:2500稀释）及标记时间（15 min）的系统优化，获得了最大化的T/B比。

分析性能：在最优条件下，校准曲线在0.17-100 nM范围内呈半对数线性关系，回归方程为Δi_c(nA) = (208 ± 13) + (388 ± 16) × log[miRNA let-7a]，相关系数R²=0.991。检出限（LOD）为0.05 nM，定量限（LOQ）为0.17 nM。十支独立制备的生物平台对10 nM靶标的相对标准偏差为4.1%，展现了良好的重现性。

室温长期储存稳定性：b-Cp-AuNPs-SF/SPCE在干燥室温条件下储存至少30天后仍保持对0和100 nM miRNA let-7a的辨别能力，无明显性能衰减，归因于SF形成的β-折叠富集网络提供的保护性微环境。

单核苷酸分辨能力：与完全互补靶标相比，含一个碱基错配的let-7f信号约为靶标的48%，含两个碱基错配的let-7g约为37%，而非互补序列miRNA-21的信号与空白相当，证实了平台的高选择性。甲基化类似物m6A-let-7a产生与靶标相当的强信号。

临床CRC组织样本分析：对CRC患者配对非肿瘤和肿瘤组织提取的总RNA进行分析，未观察到显著的基质效应。结果显示非肿瘤组织中miRNA let-7a表达水平相对均一，而肿瘤组织中该miRNA显著下调，与文献报道一致，支持其作为CRC肿瘤抑制因子的角色。受试者工作特征曲线分析表明，该平台区分非肿瘤与肿瘤组织的曲线下面积达1.00，敏感性和特异性均为100%。

结论与意义

本研究首次证明了SF作为多功能生物材料在基因传感器开发中的潜力。SF与AuNPs的协同组合赋予了生物传感器可持续性、抗污特性、简便性、灵敏度、选择性以及在室温干燥条件下长期储存稳定性的关键优势。SF提供了坚固、生物相容、机械稳定且不溶水的蛋白质支架，实现了AuNPs的有效封装和有利空间分布；AuNPs则增强了电子传递，并作为生物素化捕获探针的纳米平台促进高效杂交。优化的平台允许快速杂交和一步标记，实现了低纳摩尔范围的靶标检测、宽线性响应、良好重现性和高选择性。该杂化界面还展示了单核苷酸分辨能力，对非互补序列响应可忽略。重要的是，SF基质确保了室温干燥储存下的长期稳定性，消除了运输和储存中对湿度控制或冷藏的需求。对CRC患者配对组织样本的应用首次提供了该靶标miRNA在这些样本中的定量评估，证实了其肿瘤抑制因子的角色。该策略代表了传统巯基化探针修饰金电极平台的引人注目的替代方案，且由于生物素化分子的广泛商业可用性，该AuNPs-SF纳米架构在更广泛的亲和性生物检测应用中具有巨大潜力，可扩展至其他临床相关的RNA种类甚至DNA靶标的检测。