# 中文标题 新型青蒿素衍生物的设计、合成及生物学评价：作为克服多药耐药的强效P-糖蛋白(P-gp/ABCB1)调节剂

《RSC Advances》：Design, synthesis and biological evaluation of novel artemisinin derivatives as potent P-glycoprotein modulators for overcoming multidrug resistanceOpen Access

　　

# 摘要专业翻译

由P-糖蛋白（P-gp，ABCB1）介导的多药耐药（MDR）仍然是成功化疗的主要障碍，这凸显了对能够阻断P-gp功能并恢复药物敏感性的强效且安全药物的迫切需求。为应对这一挑战，研究人员合成并系统评价了一个新型青蒿素衍生物库。筛选鉴定出化合物A7、A12、A13、A14和A15为有效分子，其最低有效浓度（MEC）在0.19至6 μM范围内可显著降低罗丹明123（Rho123）外排。值得注意的是，化合物A16和A20表现出最高效能，其MEC低至0.049 μM。这些衍生物还能有效抑制P-gp介导的阿霉素（Dox）外排，其中化合物A16的MEC值为0.19 μM，化合物A20为0.049 μM。与上述发现一致，两种化合物分别在0.050和0.005 μM浓度下通过增敏K562/Dox细胞显著增强了Dox的细胞毒性。分子动力学模拟和多尺度QM/MM计算为理解衍生物的结合模式提供了有用线索，并鉴定了参与P-gp调节的关键结构决定因素和关键氨基酸残基。化合物A16和A20强效的P-gp调节活性，加之其在调节P-gp活性所用的纳摩尔浓度下对正常外周血单个核细胞（PBMC）无细胞毒性，凸显了这些青蒿素衍生物作为开发新型P-gp调节剂的有前景骨架。总之，计算与实验结果为P-gp抑制提供了机制见解，并为基于青蒿素的P-gp调节剂的合理设计建立了框架。

# 论文解读

## 一、研究背景与目的

癌症仍是全球导致死亡的主要原因之一，对人类和动物健康构成重大挑战，同时带来沉重的社会经济负担。尽管化疗显著改善了癌症治疗结局，但耐药性的出现持续损害其治疗效果。多药耐药（multidrug resistance, MDR）是指肿瘤细胞同时对多种结构和功能无关的药物产生耐药的现象，其涉及多种机制，其中由膜转运蛋白介导的药物外排增加被认为是MDR的主要促成因素。ATP结合盒（ATP-binding cassette, ABC）转运蛋白家族成员以ATP依赖方式主动转运广谱药物，从而阻止药物到达胞内靶点，最终降低治疗效果，常导致治疗失败。在ABC外排转运蛋白中，P-糖蛋白（P-glycoprotein, P-gp，又称ABCB1或MDR1）因其显著的底物混杂性是MDR的主要介质之一，能高效外排多种化疗药物，包括阿霉素（doxorubicin, Dox）、长春新碱和紫杉醇，以及多种内源性和外源性化合物。结构上，P-gp包含两个同源跨膜结构域（transmembrane domains, TMDs），每个TMD含六个跨膜螺旋（transmembrane helices, TMHs），以及负责ATP结合和水解的核苷酸结合结构域（nucleotide-binding domains, NBDs）。P-gp参与癌症耐药、与不良临床预后相关，并在包括白血病在内的多种恶性肿瘤中过表达，这强化了识别能抑制其外排活性的有效调节剂的迫切需求。然而，尽管历经数十年研究，第一、二、三代P-gp抑制剂在临床上的成功有限，主要归因于毒性、药代动力学相互作用、转运体选择性不足和治疗疗效有限。这些局限性推动了以天然产物衍生化合物为代表的第四代抑制剂的开发。尽管人们广泛努力将P-gp抑制转化为抗癌治疗，但P-gp抑制剂的临床开发仍然充满挑战，尚无抑制剂获批专门用于克服P-gp介导的化疗耐药。

青蒿素自发现以来已成为最重要的抗疟药物之一，并作为开发众多具有改善药理学特性衍生物的特权骨架。尽管最初开发用于疟疾治疗，这些衍生物已展现出广泛的生物活性，包括抗寄生虫、抗炎、皮肤病学和抗癌作用，以及对血液系统恶性肿瘤的活性。重要的是，多项研究表明青蒿素衍生物能在不同细胞系中部分克服P-gp介导的MDR。青蒿素、青蒿琥酯和双氢青蒿素在过表达P-gp的K562/Adr细胞中适度增强了胞内Dox蓄积和毒性。同样，据报道几种合成青蒿素衍生物在不同程度上损害P-gp功能，这在多种细胞模型的功能测定中得到了证实。这些发现为探索青蒿素衍生物作为P-gp调节剂提供了强有力的理论依据。基于当前对P-gp抑制结构要求和TMHs内参与配体识别关键残基的认识，研究人员合理设计并合成了一系列青蒿素衍生物库。这些药效团特征包括高疏水性、合适的连接基、富电子芳香部分、适当的取代基、合适的连接基柔性和有利的分子形状。基于这些考虑，研究人员合理设计、合成并生物学评价了21个青蒿素衍生物，以鉴定能够调节P-gp介导耐药的新型药物。对最具活性的化合物进一步采用分子动力学模拟和多尺度QM/MM计算，以阐明其结合模式并确定P-gp抑制的分子决定因素。

## 二、研究所用的主要技术方法

研究人员设计并合成了21个青蒿素衍生物（A1至A20），通过多种化学反应路线将青蒿素核心与不同芳香部分或含氮杂环通过不同长度的柔性连接基相连。生物学评价方面，采用MTT比色法评估化合物对K562亲本及其P-gp过表达耐药株K562/Dox细胞的增殖抑制作用；利用流式细胞术进行罗丹明123（Rho123）和阿霉素（Dox）胞内蓄积实验以评估P-gp外排抑制活性；通过Dox耐药逆转实验测定化合物恢复药物敏感性的能力；同时在人外周血单个核细胞（PBMC）和人红细胞上评价了细胞毒性和溶血活性。计算研究方面，使用Autodock Vina进行盲对接，随后开展AMBER20平台的分子动力学（MD）模拟（100 ns），结合MM-PBSA/GBSA自由能计算与逐残基能量分解，并利用多尺度ONIOM(QM/MM)计算和QTAIM分析表征蛋白-配体间的非共价相互作用。细胞系K562和K562/Dox由巴西里约热内卢联邦大学V. Rumjanek博士惠赠。

## 三、研究结果

### 3.1 青蒿素衍生物选择性抑制P-gp而不影响细胞活力

MTT测定结果显示，所有合成的衍生物以及青蒿素、青蒿琥酯和双氢青蒿素（DHA）对K562/Dox和K562细胞均未表现出细胞毒活性，所有化合物的半数抑制浓度（IC50）值均高于美国国家癌症研究所（NCI）设定的10 μM细胞毒性阈值。相比之下，强效P-gp阻断剂tariquidar表现出细胞毒活性，对K562/Dox和K562细胞的IC50值分别为2.4和2.2 μM。Rho123胞内蓄积筛选实验表明，化合物A7、A12、A13、A14、A15、A16和A20在最低有效浓度（MEC）低于10 μM时即可显著抑制Rho123外排，其P-gp调节活性显著高于在50 μM时均未表现出可检测抗P-gp活性的青蒿素、青蒿琥酯和双氢青蒿素。

### 3.2 结构优化鉴定出化合物A16和A20为强效P-gp调节剂

化合物A16和A20表现出卓越活性，其MEC值均为0.049 μM，低于参照化合物维拉帕米（MEC = 0.39 μM）和tariquidar（MEC = 1.56 μM）。在0.39 μM浓度下，化合物A16显著增强Rho123相关平均荧光强度（MFI），其抑制P-gp介导外排的效果优于同浓度维拉帕米。化合物A20在25和0.39 μM浓度下均显著增加胞内Rho123蓄积，MFI值也显著高于维拉帕米。在亲本K562细胞中，经A16或A20处理的细胞MFI值与未处理对照相当或更高，表明耐药细胞中Rho123蓄积的增加源于化合物对P-gp外排的抑制。含三个甲氧基（–OCH₃）的化合物（A6、A7、A8、A14和A15）均有效抑制Rho123外排，MEC值在0.19至12.5 μM之间。其中具有较长连接基且缺乏酯化的A14和A15活性最强（MEC = 0.19 μM）。引入卤代氨基喹啉基团显著增强了P-gp调节活性，产生测试衍生物中最低的有效浓度。

### 3.3 化合物A16和A20恢复胞内Dox蓄积并逆转多药耐药

Dox蓄积实验中，化合物A16在0.19至25 μM浓度范围内使FAR值从1.29 ± 0.09增至1.65 ± 0.09，显著增加胞内Dox蓄积；化合物A20在0.049至25 μM浓度范围内产生FAR值1.19 ± 0.02至1.52 ± 0.12的显著增加。亲本K562细胞中未观察到类似变化，表明效应特异性地与P-gp介导耐药调节相关。Dox耐药逆转实验中，化合物A16在0.40 μM时达到最大逆转倍数（FR）4.17 ± 0.95，化合物A20展现浓度依赖性效应，在相同浓度下达到最大FR值46.36 ± 10.78。化合物A16在0.05 μM时FR为1.53 ± 0.05，化合物A20在0.005 μM时FR为1.12 ± 0.04，表明两者在极低浓度即可增强Dox对K562/Dox细胞的效力。

### 3.4 对人正常细胞的细胞毒性评价

化合物A16和A20对人PBMC的IC50值分别为8.47 ± 0.06 μM和6.06 ± 0.39 μM。与产生显著逆转效应的最低浓度（A16为0.05 μM，A20为0.005 μM）相比，体外安全裕度约为170倍和1200倍。此外，两者在50 μM最高测试浓度下均未显示可检测的溶血活性，支持其良好的细胞耐受性。尽管显示了有利的体外安全裕度，但仍需进一步的体内药代动力学和毒性研究来确定这些有利裕度能否转化为可接受的治疗窗口。

### 3.5 分子动力学揭示与强效P-gp抑制相关的双接触结合模式

盲对接将全部化合物定位在P-gp由TMH4、5、6和TMH7、12形成的倒“V”形顶端附近或其内部。对12个代表性化合物进行了100–110 ns MD模拟，MM-PBSA计算的结合自由能与MEC值呈现良好相关性（R2 = 0.834）。最强效调节剂尤其是化合物A20采用特征性的“U”形构象，能同时与TMH6和TMH12形成紧密接触。关键残基包括TMH4的Ser228、Ala229、Trp232、Leu236，TMH5的Phe303、Tyr307、Ile360，TMH6的Phe336、Leu339、Ile340、Phe343、Gln347，TMH7的Gln725、Phe728，以及TMH12的Val982、Phe983、Met986、Ala987、Gln990。该类残基与紫杉醇、长春新碱和Dox等化疗药物结合所涉及的残基重叠。逐残基能量分解显示，活性化合物A16和A20与TMH4、6和12存在强相互作用，而弱活性或非活性化合物缺乏与TMH4和6的稳定接触，与TMH12的相互作用也减弱。化合物A20的“U”形构象使其青蒿素部分深埋于主要由TMH4–6和TMH12的Met986形成的疏水核心中。能够同时占据结合腔两半部分的双接触结合模式是强效抑制剂的一致特征。

### 3.6 QTAIM分析确认A16和A20结合的关键相互作用

针对非活性化合物A2（阴性对照）及化合物A16和A20进行了多尺度QM/MM/QTAIM计算。A2显著较低的Σρ(r)值与其较弱的结合亲和力一致。尽管青蒿素骨架在三个化合物中相同，但其对总相互作用密度的贡献差异显著——只有最具活性的化合物能将青蒿素骨架深置于TMH4–6与TMH12的Met986构成的疏水区域。残基逐点分解显示，Ala229和Trp232（TMH4）对A16和A20结合的贡献在该模型中更加明显，与卤代喹啉环的高极化性和富电子特性一致。化合物A20与TMH10的Leu879和Met876的额外接触是其与A16的主要差异，且与先前报道的tariquidar相互作用相似。TMH6的Leu339、Phe343、Gln347，TMH7的Gln725，TMH12的Phe983特别是Met986的贡献，揭示了涉及两个同源半通道（TMH4–6和TMH7、12）接触强度之间的平衡。该相互作用模式与此前多个化学家族P-gp调节剂研究中的观察一致。

## 四、总结与结论

讨论部分指出，尽管P-gp抑制剂具有逆转MDR的潜力，但既往临床候选药物因毒性和药物-药物相互作用而受限。全身性P-gp抑制可能增加合并用药的P-gp底物药物的暴露量和毒性。近年来研究强调天然产物与常规药物合并用药时可改变药物暴露，例如川芎与华法林联用改变了senkyunolide I的药代动力学。这些发现强调了仔细评估化合物A16和A20的药代动力学、安全性和相互作用特征的重要性，以在MDR逆转获益与潜在药物相互作用风险之间取得平衡，并确定其转化可行性。

研究结论为：设计并合成了系列青蒿素衍生物，其特点是不同长度的连接基将青蒿素核心与甲基苯基或含氮杂环相连。考虑到许多第三代P-gp抑制剂（如tariquidar）包含四氢异喹啉骨架，研究中将该结构部分引入设计化合物作为次级环系统。化合物A7、A12、A13、A14、A15、A16和A20对P-gp介导的Rho123外排表现出强效抑制作用。其中A16和A20活性最强，MEC值低至0.049 μM，两种化合物均显著增加Dox胞内蓄积，从而在纳摩尔浓度下使K562/Dox细胞对该细胞毒药物增敏。重要的是，两种化合物在有效浓度下均不影响正常PBMC的增殖，凸显了A16和A20作为克服P-gp相关MDR的有前景骨架。结构分析揭示喹啉部分的存在和更长的连接基长度增强了抗P-gp活性。分子动力学模拟支持这些青蒿素衍生物的调节活性与其在P-gp结合口袋内采用紧凑稳定构象的能力密切相关。特别是维持特征性“U”形构象、与关键残基的持续相互作用以及同时占据疏水性和极性区域，似乎是区分活性与非活性化合物的关键决定因素。值得注意的是，发生在TMH12附近（该区域功能上与催化结构域相连）的相互作用提示可能影响调节转运活性的构象转变。计算结合能与预测相互作用模式和实验数据之间的一致性，强调了整合建模与模拟方法以合理化生物活性的重要性。这些发现不仅加深了对最有前景衍生物作用机制的理解，还为指导新型P-gp调节剂的合理设计建立了具体结构标准。此外，由第一性原理DFT和多尺度计算补充的详细结合模式分析，确认了先前研究中关于强效调节活性所需关键结构决定因素的假设。