Huayu Wan（HYW）通过破坏谷胱甘肽代谢和促进NCOA4相关铁蛋白自噬诱导铁死亡并增强抗PD-1治疗顺铂耐药食管鳞状细胞癌的疗效

《Frontiers in Immunology》：Huayu Wan induces ferroptosis and enhances anti-PD-1 efficacy in cisplatin-resistant esophageal squamous cell carcinoma

　　

顺铂耐药仍然是食管鳞状细胞癌（ESCC）治疗中的主要挑战。在此，研究人员探讨了Huayu Wan（HYW）在顺铂耐药ESCC中的抗肿瘤作用及其潜在机制。HYW显著抑制顺铂耐药人KYSE150细胞和小鼠mEC25细胞的生长，并诱导以活性氧（ROS）蓄积、细胞内铁增加、谷胱甘肽（GSH）耗竭、脂质过氧化和GPX4表达降低为特征的铁死亡表型。Ferrostatin-1部分逆转HYW诱导的细胞毒性。HYW还促进免疫原性细胞死亡（ICD）相关改变，包括细胞外ATP和HMGB1释放以及细胞表面钙网蛋白（CALR）暴露。机制上，HYW增加p53表达并损伤SLC7A11/GCLC依赖性胱氨酸–谷胱甘肽抗氧化系统，而GCLC过表达和P53抑制部分恢复氧化还原稳态和细胞存活。同时，HYW抑制AKT–mTOR信号并促进NCOA4相关铁蛋白自噬，表现为NCOA4和LC3-II增加及FTH表达降低。药理学抑制自噬和NCOA4敲低减弱铁蓄积和HYW诱导的细胞毒性。在顺铂耐药同系肿瘤中，HYW抑制肿瘤生长且总体系统耐受性可接受，增强铁死亡和免疫应激相关改变，降低PD-L1表达，并增加CD8⁺ T细胞浸润。此外，HYW联合抗PD-1治疗较任一单药治疗产生更强的抗肿瘤作用。这些发现提示，HYW通过协同破坏谷胱甘肽代谢和NCOA4相关铁蛋白自噬促进铁死亡，同时增强顺铂耐药ESCC中的抗肿瘤免疫应答。

论文主体解读如下：

研究背景与意义：食管鳞状细胞癌（ESCC）在东亚高发且生存率长期不佳，顺铂为基础的一线方案是晚期ESCC的主要系统治疗，但内在和获得性耐药是治疗失败与复发的主要原因。铁死亡（ferroptosis）是铁依赖、脂质过氧化驱动的调节性细胞死亡，可整合代谢重编程、氧化还原失衡和铁稳态影响ESCC治疗反应；对顺铂耐药的肿瘤细胞常发生代谢适应，从而更易发生铁死亡。天然多组分复方具有多靶点调控和较好生物相容性。Huayu Wan（HYW）源于桃红四物汤和抵当汤，传统用于“Zhengjia”“Jieju”等血瘀相关肿块，已有临床和实验研究提示其与化疗联合或调节肿瘤灌注、抑制肺癌生长转移，且部分成分具有ESCC抑制作用；但HYW在ESCC特别是顺铂耐药ESCC中是否诱导铁死亡及其机制尚不清楚，因此研究人员开展本研究。研究结论显示，HYW在顺铂耐药ESCC模型中保留抗肿瘤活性，通过破坏谷胱甘肽抗氧化防御和促进NCOA4相关铁蛋白自噬诱导铁死亡，并增强抗PD-1疗效；其意义在于识别顺铂耐药ESCC的铁死亡治疗弱点，为克服顺铂耐药和免疫联合治疗提供候选策略。

关键技术方法（≤250字）：研究人员建立人KYSE150/CDDP和小鼠mEC25/CDDP顺铂耐药亚系（KYSE150购自Procell，mEC25购自Otwo Biotech），采用CCK-8、EdU、克隆形成和软琼脂实验评估增殖与锚定非依赖生长；采用UHPLC-Q-Orbitrap-HRMS成分谱、ADME筛选、网络药理学、PPI网络及GO/KEGG富集分析；采用流式细胞术、荧光显微、铁含量、GSH/GSSG、MDA、ATP/LDH、ELISA、qPCR、Western blot和胱氨酸摄取检测；通过Fer-1、Z-VAD-FMK、Nec-1、PFT-α、3-MA、GCLC过表达和NCOA4敲低进行功能验证；在C57BL/6小鼠mEC25-CDDP同系皮下瘤模型评价HYW及与抗PD-1联合。

研究结果：
1）HYW suppresses the growth of cisplatin-resistant ESCC cells（HYW抑制顺铂耐药ESCC细胞生长）：研究人员通过逐步增加顺铂浓度建立KYSE150/CDDP和mEC25/CDDP，其顺铂IC50升高且P3至P10耐药表型较稳定，选P5用于后续；CCK-8、EdU、克隆形成和软琼脂实验显示HYW以时间和剂量依赖方式降低细胞活力、抑制DNA合成、克隆存活和锚定非依赖生长，结论为HYW在体外对顺铂耐药ESCC细胞保留明显抗肿瘤活性。
2）HYW compromises the ferroptotic defense system in cisplatin-resistant ESCC cells（HYW削弱顺铂耐药ESCC细胞的铁死亡防御系统）：通过ROS、JC-1、FerroOrange、总铁、GSH/GSSG、MDA和Western blot检测，HYW增加ROS和Fe²⁺及总铁、引起线粒体去极化、降低GSH/GSSG、升高MDA并降低GPX4；同时增加细胞外ATP、HMGB1释放和CALR表面暴露，结论为HYW诱导铁死亡表型并伴随ICD相关DAMPs释放。
3）Ferroptosis inhibition alleviates HYW-induced cytotoxicity in cisplatin-resistant ESCC cells（抑制铁死亡减轻HYW诱导的细胞毒性）：通过Fer-1、Z-VAD-FMK和Nec-1干预，Fer-1挽救作用最强，Z-VAD-FMK中等，二者联合进一步恢复细胞活力；Fer-1部分逆转克隆形成和EdU抑制、降低Annexin V/PI死亡比例，并恢复GSH/GSSG、降低铁和MDA，结论为铁死亡在HYW诱导的细胞死亡中占主导。
4）Identification of candidate bioactive components and potential therapeutic targets of HYW in ESCC（鉴定HYW在ESCC中的候选活性成分和潜在治疗靶点）：通过39个已报道成分的ADME筛选、毒性预测、靶点预测和网络分析，得到172个重叠靶点，占ESCC相关潜在治疗靶点的72.3%；度值前列成分为quercetin、daidzein、epicatechin、calycosin、medicarpin等，定量显示allocryptopine含量最高（360.01 mg/kg）；验证前五成分发现quercetin、daidzein、epicatechin和calycosin降低细胞活力，Fer-1部分挽救quercetin、epicatechin和daidzein的毒性并伴随GSH/GSSG和MDA改变，结论为HYW具有多成分、多靶点调控潜力。
5）Network-based identification of core targets and signaling pathways underlying HYW action in ESCC（基于网络鉴定HYW作用于ESCC的核心靶点和信号通路）：通过PPI网络构建和GO/KEGG富集，网络包含172个节点和7060条边，核心节点包括AKT1、P53、TNF、EGFR、IL6、STAT3、BCL2L1、MAPK1和HSP90AA1；GO富集涉及膜外、膜筏、囊泡腔、氧化应激和缺氧反应等，KEGG富集包括PI3K–AKT和p53信号通路，结论为HYW可能通过多通路协调应激、炎症和免疫调节发挥作用。
6）HYW impairs the SLC7A11/GCLC-dependent cystine–glutathione antioxidant system（HYW损伤SLC7A11/GCLC依赖性胱氨酸–谷胱甘肽抗氧化系统）：通过HYW靶点与铁死亡基因交集富集到谷胱甘肽代谢，Western blot和qPCR显示HYW升高p53并降低SLC7A11、GCLC、NRF2和GPX4表达，胱氨酸摄取下降；GCLC过表达部分恢复GSH/GSSG、降低MDA并减轻生长抑制，PFT-α抑制p53部分恢复SLC7A11、胱氨酸摄取、GSH/GSSG和细胞活力，结论为HYW破坏System Xc^?-谷胱甘肽抗氧化通路。
7）HYW activates autophagy and ferritinophagy via inhibition of the AKT–mTOR pathway in cisplatin-resistant ESCC cells（HYW通过抑制AKT–mTOR通路激活自噬和铁蛋白自噬）：通过LC3B检测、铁代谢基因qPCR和Western blot，HYW增加LC3B斑点、NCOA4和LC3-II并降低FTH，同时降低p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR比值；3-MA部分减轻铁蓄积和MDA升高、降低LDH释放并恢复活力，NCOA4敲低降低LC3-II和细胞内铁并部分恢复活力，结论为AKT–mTOR抑制和NCOA4相关铁蛋白自噬参与HYW诱导的铁动员和铁死亡。
8）HYW suppresses tumor growth and enhances ferroptosis and immune activation in vivo（HYW在体内抑制肿瘤生长并增强铁死亡和免疫激活）：通过C57BL/6小鼠mEC25-CDDP同系皮下瘤模型，HYW剂量依赖抑制肿瘤体积和重量，体重及主要器官指数无明显变化，血清ALT、AST、BUN无明显改变而高剂量组肌酐轻度升高；肿瘤组织GSH/GSSG降低、MDA升高，HMGB1、ATP、CXCL9和CXCL10升高，TUNEL阳性增加且GPX4降低，PD-L1降低而CD8α⁺ T细胞浸润增加；HYW联合抗PD-1较单药进一步抑制肿瘤生长和降低瘤重，结论为HYW在体内诱导铁死亡相关氧化应激和免疫激活，并增强PD-1阻断疗效。

讨论部分总结：讨论指出，天然产物可通过调控肿瘤细胞存活通路克服化疗耐药；顺铂耐药ESCC存在氧化还原代谢重编程，SLC7A11上调增强谷胱甘肽合成并逃避铁死亡；p53可抑制SLC7A11，NRF2调控胱氨酸转运、谷胱甘肽合成和脂质过氧化物解毒。本研究中HYW降低NRF2、SLC7A11和GCLC，导致GSH耗竭和GPX4介导的脂质过氧化物解毒受损；HYW经AKT/mTOR/NCOA4轴诱导铁蛋白自噬，铁蛋白降解增加不稳定铁池并催化脂质过氧化；双重作用使顺铂耐药ESCC细胞处于铁死亡易感状态。讨论还指出，HYW处理肿瘤中CD8⁺ T细胞浸润增加、PD-L1降低，铁死亡相关DAMPs如HMGB1和ATP可激活树突状细胞并启动T细胞；PD-L1可抑制SLC7A11和谷胱甘肽产生，高PD-L1肿瘤对铁死亡更敏感，HYW可优先清除免疫逃逸群体，降低肿瘤负荷并增强CD8⁺ T细胞浸润和效应，从而增强抗PD-1阻断。

研究结论（翻译）：总之，本研究将HYW鉴定为在顺铂耐药ESCC模型中具有抗肿瘤活性的铁死亡诱导治疗。HYW破坏以谷胱甘肽为中心的抗氧化防御并促进铁蛋白自噬相关铁动员，从而增强脂质过氧化和铁死亡。体内，HYW抑制顺铂耐药ESCC肿瘤生长，并与PD-L1表达降低、CD8⁺ T细胞浸润增加及PD-1阻断抗肿瘤活性增强相关。这些发现突出HYW作为顺铂耐药ESCC替代治疗策略的潜力，并值得进一步研究其补充现有治疗的能力。