壳聚糖（CS）基可注射水凝胶在骨再生中的演进：从原位凝胶化、刺激响应到临床转化的批判性综述

《Advanced Materials Interfaces》：A Critical Review on the Evolution of Chitosan-Based Injectable Hydrogels in Bone Regeneration

　　

可注射水凝胶正在重新定义骨与组织工程领域的策略，为传统移植手术提供微创途径。在所有天然聚合物中，壳聚糖（CS）因其固有的生物可降解性和生物相容性而被认为是有前景的候选材料。本综述概述了壳聚糖基水凝胶系统用于骨再生的进展。溶胶–凝胶（sol–gel）转变机制包括物理和化学策略，这些策略允许在体内原位形成支架。特别强调解决壳聚糖的关键缺陷，如低机械强度等。讨论了增强策略，包括生物活性陶瓷和多阶段生长因子递送机制，有助于增加血管生成和骨传导。本综述还强调创建对生物刺激如活性氧（ROS）和酶响应的“智能”水凝胶，用于骨软骨损伤和感染性骨缺损。此类多功能系统可能有助于改善治疗结果、减少疾病相关并发症，并实现更可及和包容的卫生干预。研究人员结合近期体外（in vitro）和体内（in vivo）研究数据，评估这些生物材料的转化潜力并指出临床采用的主要障碍，为下一代定制化再生治疗打开大门。

1 Introduction：文章指出可注射水凝胶模拟细胞外基质（ECM），由可降解多孔天然聚合物构建，能在生理pH和温度下原位交联形成临时支架，并通过受控降解和生物活性因子支持再生。壳聚糖（CS）因生物相容性、可降解性及pH/温度敏感凝胶化而被广泛研究；NaHCO₃、Na₂CO₃或β-甘油磷酸盐（β-GP）可中和CS溶液并实现物理交联，分子量和脱乙酰度（DDA）可调控降解与溶胀。CS水凝胶用于伤口愈合、骨修复和软骨再生；与羟基磷灰石（HA）等生物陶瓷复合可增强骨传导、细胞功能和骨整合，并在模拟体液（SBF）中形成碳酸化磷灰石层。血管生成是再生关键，肝素功能化支架可增强血管生成。本综述讨论CS基可注射水凝胶作为微创骨修复材料的潜力、交联与凝胶化、陶瓷/纳米颗粒/金属离子/生长因子复合、体外（in vitro）和体内（in vivo）证据及前景。

2 Chitosan: Properties and Chemistry：CS为甲壳素脱乙酰化所得阳离子生物聚合物，含羟基和氨基，可化学修饰；具低免疫原性、抗菌性、生物相容性和可降解性。氨基可质子化/去质子化，赋予pH响应性：低pH下溶胀溶解增强，高pH下链塌缩。CS具生物活性和骨传导性，可负载干细胞、生长因子和纳米颗粒。其局限包括中性和碱性pH溶解性差、物理交联网络稳定性有限、机械强度不足；采用羧甲基化、β-GP引入、甲基丙烯酰化或共混等改性。CS化学和生物特性使其成为可注射骨再生水凝胶的灵活基础。

3 Formulation, Gelation and Synthesis of Chitosan-Based Injectable Hydrogels：本节关注可流动前驱液在生理条件下形成三维网络，比较物理与化学交联。3.1 Physical Cross-linking Methods：物理交联依赖离子相互作用、热响应、疏水组装或超分子复合，而非共价反应。3.1.1 pH-Responsive Hydrogels：pH响应CS水凝胶利用弱酸聚合物电离构象变化，产生离子作用和氢键，实现可逆凝胶化；双响应系统如氧化葡聚糖/苯硼酸可实现DOX控制释放。β-GP在生理温度诱导CS转变，季铵化CS/β-GP可包封生物分子和细胞，CS–胶原复合可低温注射原位成胶，但季铵化CS组织毒性需关注。双交联CS–海藻酸盐经Nb–Tz点击反应具可调凝胶化和控制释放。经典CS/β-GP热凝胶机械性能差，引入氧化石墨烯（GO）、胶原、TCP或nHAp增强后仍难匹配金属或致密陶瓷，适合非承重/低应力缺损。β-GP存在生物相容性窗口，过高浓度降低细胞代谢活性和增殖，需优化浓度和清洗。3.1.2 Thermoresponsive Sol–Gel Transition：热响应溶胶–凝胶转变由聚合物链重排驱动；PEG、PNIPAM、Pluronic F-127等低于LCST互溶，升温后疏水聚集形成网络。PEG化CS在接枝率>40%时生理温度成胶并可包封BSA释放达40天；硫醇–丙烯酸酯化学可避免醛类修饰问题。物理交联网络分子间键弱，机械完整性有限；CS–Pluronic（CP）凝胶改善溶胶–凝胶行为和力学，适合可注射软骨支架；CD-g-CS热响应系统可在骨缺损快速原位成胶。3.1.3 Composite Physically Cross-Linked Systems：碳纳米管（CNTs）和透明质酸（HA）等引入杂化系统；HA与CS静电交联提高黏附性和压缩模量，快速成胶并具生物活性，可负载蛋白。CNTs高长径比和刚性增强结构完整性，HA-CS网络促进细胞黏附和增殖；复合系统兼顾生物功能与机械稳健性。

3.2 Chemical Cross-linking Methods：化学交联通过原位聚合形成共价连接，提高力学、加快凝胶化并减少突释；包括光聚合、点击化学、热聚合和席夫碱反应。3.2.1 Covalent Cross-Linking and Click Chemistry：CS游离氨基与硫醇、丙烯酸酯或醛交联剂反应；与HA经席夫碱交联改善力学、缩短凝胶化并调控孔径，适合软骨细胞包封。氧化CS与CS形成可逆亚胺键，构建动态自愈合水凝胶。点击反应条件温和、化学选择性高；无金属的氧杂降冰片二烯介导修饰可制备生物相容CS水凝胶，支持干细胞包封；传统叠氮或金属催化点击反应有毒性顾虑。3.2.2 Photo Cross-linking：紫外（UV）引发交联可时空控制凝胶化；PEG修饰降低凋亡，但Irgacure 2959等光引发剂可产自由基致细胞毒性。低剂量UV（10 mW cm^?2，15 s）制备N-甲基丙烯酰CS水凝胶改善透皮给药；CMCS-PNIPAM-GMA双响应水凝胶实现温度和pH调控释放；CMCS-g-AMEA快速UV凝胶化并促进神经细胞分化。光响应CS水凝胶可实现骨缺损内空间控制递送。需权衡光引发剂剂量和曝光时间：浓度升高或UV延长可致细胞活力几乎完全丧失；光交联凝胶化时间10–30 min需较长UV暴露，限制构建厚度并加重光毒性。可见光/红光引发剂和无金属点击化学可降低毒性但增加合成复杂性和成本；席夫碱和点击交联CS动态网络可自愈合可注射，但在酸性环境可水解，炎症骨缺损中可能早期失稳；氧杂降冰片二烯和叠氮点击体系存在残留小分子和金属污染顾虑。3.2.3 Supramolecular and Ionic Chemical Cross-linking：二价阳离子（Ca²⁺、Zn²⁺）与CS或与海藻酸盐等阴离子生物聚合物离子交联，形成力学可调水凝胶；CS-海藻酸盐-Ca²⁺水凝胶在脊髓再生中显示潜力。超分子水凝胶包括环糊精（CD）基体系，利用氢键和主客体作用，具触变性和剪切变稀可注射性；Pluronic载药胶束加α-CD形成稳定水凝胶，实现近线性长效释放。离子交联高度可逆，pH和离子强度变化可破坏网络，导致力学丧失或早期药物泄漏；Ca²⁺交联体系可被磷酸根竞争和体内螯合逐渐脱交联，有利于降解但不利于需数周机械支撑的情况。CD基超分子CS水凝胶具触变和可注射性，但弹性、韧性有限、降解快、不能承受生理载荷，适合非承重部位或与刚性填料复合。

4 Stimuli-Responsive CS-Based Injectable Hydrogel：CS为刺激响应水凝胶提供可调基础，可通过聚合物组合和热聚合、光聚合、双聚合物交联等实现。原位成胶对骨缺损再生重要，水凝胶作为临时支架随时间降解并促进成骨细胞增殖分化。pH和温度响应体系在临界骨缺损中有效；可注射性利于难达部位并适应缺损形状，凝胶化无需聚合添加剂、外部触发或有机溶剂。刺激包括物理（压力、温度、光、磁场）、化学（pH、葡萄糖、离子强度）和生物（DNA、酶、抗原）触发。此类系统仍存在部分配方生物相容性差、潜在免疫原性和承重缺损机械稳定性不足；CS水凝胶即使增强后仍逊于金属支架用于关键承重，降解可能导致骨再生完成前性能下降。4.1 Thermosensitive CS Based Injectable Hydrogels：温度敏感水凝胶低于临界溶液温度（CST）为流体，高于CST成胶，CST接近生理温度最适用。CS本身不具热敏性，需引入两亲热敏聚合物或功能羟基。CS/β-GP水凝胶广泛用于递送生物分子和生长因子并支持多层细胞/组织；加入酸溶性胶原（ASC）模拟骨样条件，复合TCP、nHAp、nBG或硅灰石（WS）促进骨整合和力学。CS/GP仍未达到理想力学和生物学性能。PNIPAM基CS水凝胶提高细胞黏附、力学和增殖；O-烯丙基CS/PNIPAM经硫醇–烯烃点击快速成胶，体外和皮下注射无毒性/炎症；HA-CS-PNIPAM结合双相磷酸钙（BCP）显著提高成骨细胞增殖、ALP活性、基因表达、矿化、钙沉积和力学，并在裸鼠诱导异位骨。CS/PNIPAM支架支持载药；姜黄素负载CS-g-pN纳米凝胶具良好生物相容性。设计需优化力学、溶胶–凝胶时间、孔隙率和热敏聚合物选择。4.2 pH-Responsive CS Based Injectable Hydrogels：pH敏感水凝胶随环境pH发生质子化/去质子化，改变力学和化学结构；分为阳离子、阴离子和两性离子敏感型。CS氨基可构建阳离子pH响应水凝胶，在骨再生中可在酸性微环境靶向释药，对感染性骨缺损有意义。Chen等开发非对称微流控CS装置实现无外部触发精确pH响应释药，体外抗菌、生物相容和选择性释放好。碱性响应水凝胶较少，因为感染或损伤骨多为酸性/中性；多数研究设计中性pH工作并符合骨愈合需求。4.3 Biologically Responsive CS Based Injectable Hydrogels：损伤组织具特定酶浓度、ROS水平和生化参数。CS生物相容、功能基团和可调理化性质适合局部微环境；氨基和羟基可修饰以响应酶、ROS、谷胱甘肽（GSH）等。研究主要发展ROS响应CS水凝胶用于骨折后骨微环境；ROS影响愈合级联。CS响应ROS有两途径：激活人细胞抗氧化通路以抑制氧化应激；作为内在抗氧化剂清除ROS，保护膜、脂质、蛋白和核酸，源于ROS与羟基和反应性氨基作用稳定自由基。ROS响应CS骨再生水凝胶开发仍有限，研究倾向于在CS体系中组合多种ROS响应剂以改善氧化微环境和活性分子递送；CS纳米颗粒/微球比表面大，可能提高生物响应和ROS清除效率。尽管体外和小动物数据强，CS可注射水凝胶临床转化受机械不匹配承重骨、降解动力学不确定、灭菌和放大困难、复杂化学和纳米材料安全性等限制；许多情况下需与刚性固定装置联用或作为辅助而非独立骨替代物。

5 CS Based Nanoparticles Hydrogels：化学或物理交联纳米凝胶具合适纳米结构，可负载大分子药物和生物活性剂，亲水性保持酶活性和蛋白构象，实现精确可控释放。骨修复中功能纳米颗粒提高生物活性、化学性能和力学；金属/金属氧化物（金、MgO、Fe₃O₄）、聚合物纳米颗粒（超支化聚酯、树枝状聚合物、天然/合成）和无机/陶瓷（硅酸盐、GO、HA）具矿化促进能力。纳米颗粒可调物理性质：nHAp经二级氢键增强网络提高刚度；β-TCP改变CS溶胶–凝胶转变；压电纳米颗粒如PDA修饰钛酸钡（PBT）与CS形成多孔压电水凝胶具免疫调节和成骨。纳米凝胶控制释放和载药利于感染性骨缺损；喷雾干燥PLGA/PLA纳米粒载利奈唑胺整合CS水凝胶治疗骨感染。刺激响应纳米凝胶用于pH/GSH触发肿瘤靶向。CS水凝胶负载纳米颗粒可缓释Ca²⁺和Si⁴⁺刺激血管生成和新骨形成；Fe₃O₄-HA-CS（FHCS-5）水凝胶强效促进骨再生。毒性需关注：CS纳米颗粒剂量依赖性细胞毒性，高浓度活力下降，系统暴露后肝肺肉芽肿；CS纳米凝胶在动物和关节细胞中短暂炎症和轻度剂量依赖毒性，合成参数（尺寸、电荷、交联剂）影响毒性；金属/无机纳米颗粒失控释放和系统再分布是安全顾虑，银纳米颗粒24 h内可至肝、肾、脾；纳米颗粒骨诱导潜力低、力学弱、尺寸多分散和团聚影响可重复性并增加炎症/系统毒性。HA或GO增强也有警告：CS/GP-GO研究指出GO细胞相容性有争议且剂量依赖毒性，安全浓度窗口小；长期安全/清除受颗粒类型、剂量和研究设计异质性挑战。

6 Growth Factor Delivery Using CS Based Injectable Hydrogels：大骨缺损需移植；PDGF和BMP-2等生长因子虽改善骨再生，但成本高、异位骨形成和超生理剂量风险。骨愈合涉及顺序信号，序贯递送优于同时递送；PDGF-BB早期招募间充质干细胞并通过VEGF诱导促进血管生成，BMP-2后期支持成骨和有组织骨形成。CS/GP可注射水凝胶提供微创递送，但蛋白负载因多孔水合网络突释。解决方式为将载生长因子微球嵌入CS水凝胶；海藻酸盐微球Ca²⁺交联保持生长因子活性并通过交联密度调控释放。PDGF-BB载于海藻酸盐微球早期释放；BMP-2用CS-聚乳酸（CH-PLA）核心和海藻酸盐壳的核–壳微球，ALG外层Ca²⁺交联稳定微球，CH-PLA疏水PLA段限制溶胀并提高BMP-2包封。该设计降低溶胀指数、提高BMP-2包封率并略延迟释放；将PDGF负载ALG微球和BMP负载ALG包覆CH-PLA微球嵌入CH/GP水凝胶形成序贯、保活性的复合递送系统。

7 Ceramic Phase Reinforcement and Bioactive Metal Incorporation in CS-Based Injectable Hydrogels：无机相增强主要调节力学线索和离子释放，同时保持可注射性和细胞相容性。纳米生物活性玻璃（nBG）提供Si²⁺、Ca²⁺等成骨离子，在SBF中形成磷灰石并增加矿化；CS-GP复合材料流变和凝胶化适合微创递送。生物活性玻璃和明胶增强提高弹性模量（5.4 Pa至12.4 Pa）和稳定正电荷表面，仍可注射（<4.0 N）且细胞相容。nBG加入SBF降低质量损失并提高干细胞活力27%，体内验证无毒并促进新组织生长。铜掺杂生物活性玻璃（Cu-BG）嵌入CS/丝素蛋白/β-GP凝胶可缓释Ca、Si、Cu离子，促进成骨和血管生成，在临界尺寸颅骨缺损中实现血管化矿化组织再生而无需额外细胞或生长因子。动态硬化CS可注射水凝胶显著改善颅骨修复，优于低/高刚度对照；CS基可注射载细胞水凝胶微球提高成骨活性；可注射水凝胶系统促进去卵巢大鼠临界骨形成并增强骨软骨修复。GO增强CS/β-GP水凝胶在0.5% GO时压缩模量约提高1.8倍（约3.95±0.68至6.96±0.43 kPa，2% GO达11.61±2.19 kPa），保持孔隙率约81%–88%和50–70 μm互联孔；低GO负载下MC3T3-E1细胞黏附和增殖与对照相似，37°C凝胶时间缩短约20%（9.0±0.4至7.25±0.29 min）。O-羧甲基壳聚糖/遥爪PEG水凝胶显示应变硬化、自愈合、可逆储能模量增加和损伤后快速恢复，仍可降解并促进伤口闭合。动态硬化配方可更准确模拟骨ECM时间依赖力学；明胶/海藻酸钠复合水凝胶程序化基质硬化在鼠颅骨缺损中优于低/高刚度静态对照。

8 Applications: Authentication From In Vitro and In Vivo Studies：CS基可注射水凝胶具再生医学、免疫调节和药物递送多功能。热敏CS/β-GP水凝胶支持hASCs、hBMSCs和髌下脂肪垫来源细胞，体外14天维持约60%–80%代谢活性和活力；P0基质血管组分（SVF）细胞无需扩增即可存活，三维网络支持肌肉骨骼分化。GACS-l-OKGM水凝胶用于不规则伤口多模式治疗。CS/HA复合和CS纳米复合水凝胶增强基质产生和MSC软骨形成；室温可注射、生理条件成胶，适合骨软骨缺损、半月板再生和关节镜软骨修复。体内研究显示CS水凝胶4–12周结构稳定和可预测降解；组织学见胶原丰富囊膜、细胞浸润和渐进重塑，提示建设性组织整合而非异物包封。小动物研究提供平台级证据：可注射CS水凝胶促进长期细胞活力、定向肌肉骨骼分化和宿主组织整合。CS水凝胶适合骨软骨缺损填充、软骨/半月板修复及脂肪/腱鞘软组织重建，因可顺应不规则缺损后固化。CS阳离子性、黏附性和β-GP热凝胶化支持蛋白、小分子和抗炎剂负载释放；高DDA（91%–95%）水凝胶炎症反应远低于低DDA，适合长期药物储库。可用于术后储库、局部生长因子（TGF-β1、IGF-1、BMP-2、VEGF）释放、靶向抗炎或DMOAD递送及关节内镇痛；CS基质可递送肽、抗生素和抗癌分子并延长保留；地塞米松显著减少水凝胶诱导水肿。

9 Biological Applications of CS-Based Hydrogels：CS水凝胶因生物活性、相容性和ECM模拟性用于组织再生、伤口愈合、细胞移植和药物递送；可注射和自愈合利于非侵入治疗。本节按再生医学与组织工程、伤口愈合、细胞移植与药物递送分组，基于第8节体外/体内验证，说明交联化学、刚度、降解性和负载如何适配组织力学生物学需求。9.1 Regenerative Medicine and Tissue Engineering：组织工程用可注射水凝胶应生物相容、低免疫原性、可控孔隙以支持细胞浸润和营养扩散；水合ECM样网络和自愈合行为适合非侵入再生。自愈合CS水凝胶增强心脏功能、保护移植细胞并减小梗死面积；软骨修复中递送软骨生成细胞、生长因子和ECM成分，自愈合维持支架完整性；CS水凝胶模拟骨ECM并促进成骨。CS-磷酸铝热凝胶加HA在MC3T3-E1中有效递送BMP-2，注射4 mg mL^?1 rhBMP-2负载CS–AHP凝胶后出现异位骨；8周时轻度纤维包封和中性粒细胞提示慢性炎症，但蛋白活性未变。水凝胶促进骨缺损修复、血管生成和矿化，并用于骨关节炎管理；CMCS水凝胶强湿组织黏附和抗菌适合口服给药和牙周炎治疗；还用于导电CMCS填充导管神经再生和骨骼肌再生。近期颅骨和长骨缺损研究显示CS可注射水凝胶可匹配或优于商业骨移植：工程化甲壳素/CS多动态共价键水凝胶压缩模量>10 kPa，至少8周持续降解，骨填充和矿化与同种异体骨相当或更优，同时维持rBMSCs活力和成骨分化。伤口愈合方面，CS水凝胶形成抗菌、湿润和止血环境，促进修复；多孔网络允许氧交换和渗出液吸收，抗氧化性促进愈合；负载EGF等生长因子增强血管生成、控菌和胶原沉积，帮助糖尿病伤口；急性伤口需快速止血和黏附；抗炎作用帮助压疮和胃溃疡愈合；抗菌并缓释布洛芬改善运动损伤；羧甲基CS–巯基乙酸钠盐/姜黄素水凝胶改善烧伤创面血管生成和闭合。自愈合可注射水凝胶因黏弹性降低注射剪切应力，保护细胞活力；三维微环境维持形态和组织化，快速力学恢复支持移植构建体长期结构完整；对关节内和颌面适应症重要，剪切变稀可注射材料需快速再硬化以承受关节负荷或咀嚼力并保护MSC/软骨细胞。

10 Future Outcomes：CS基可注射水凝胶在生物相容性、伤口愈合和自愈合方面进展快；近期研究关注结构设计、多功能生物活性和力学增强。杂化交联或可逆动态共价键可在温和条件原位成胶和可注射。局限包括席夫碱交联力学较低、许多配方需劳动密集型CS化学修饰、杂化水凝胶金属离子毒性。体内数据有限，临床转化受限于体外研究；啮齿动物不完全模拟人皮肤生理，猪模型昂贵且技术要求高；糖尿病或生物膜感染伤口模型缺乏标准方案，降低可比性和机制理解。单一配方难以满足炎症、增殖和重塑各阶段生化需求，需定制、阶段特异和抗氧化响应敷料。当前策略将纳米材料加入水凝胶提高抗炎和抗菌；但纳米毒性、尺寸依赖渗透和伤口异质性仍是主要问题。较小流体动力学直径和较低DDA加重免疫细胞和斑马鱼胚胎ROS生成、DNA损伤和发育毒性；CS纳米凝胶/纳米颗粒在等效质量剂量下通常比本体聚合物更具细胞毒性和促氧化性；原因包括未反应交联剂/表面活性剂残留、剂量指标不明确（质量vs颗粒数/表面积）及长期生物分布、蓄积和清除信息不足。金属纳米颗粒负载CS水凝胶（Ag、Au、ZnO）提高抗菌和加速感染/糖尿病伤口闭合，但体内毒性、慢性器官蓄积和潜在耐药仍待表征。临床转化瓶颈包括CS分子量和DDA批次差异、温和细胞相容交联化学放大、灭菌不改变凝胶行为困难、与生物制品/细胞/电子组件组合的监管复杂性；短期啮齿动物研究多、大动物数据少、结果指标不标准。解决需统一CS基纳米/微水凝胶理化表征和报告标准（CS来源、DDA、Mw、相关介质中粒径分布、zeta电位、金属离子释放），用人皮肤、关节、免疫和内皮细胞面板做剂量–反应及高内涵成像检测遗传毒性和氧化应激，开展长期GLP合规大动物研究监测聚合物和嵌入纳米材料生物分布、免疫原性和器官蓄积；用计算机模型预测纳米颗粒在异质伤口床运输和清除以减少体内设计空间。从被动支架到氧化应激响应或特定环境响应系统是治疗糖尿病等伤口的重要进展；复合水凝胶结合微球/纳米凝胶与基质可解决突释，实现骨愈合级联所需序贯持续生长因子递送；可喷雾CS水凝胶如HPC/CCS/ODex-IGF1包封IGF-1，通过抗炎和抗菌促进感染伤口愈合。未来需整合材料科学、细胞生物学和计算建模，设计个性化纳米材料并提高生物安全性和靶向治疗；3D生物打印和实时电子皮肤传感器等有助于精准伤口护理；与下一代智能CS水凝胶结合可能克服限制并实现自适应患者特异伤口治疗；颌面和牙周适应症因局部递送、缺损体积小和手术易达，可能降低监管和安全门槛，是首批转化试点机会；临床前研究需系统纳入转化考虑、标准模型、现实缺损尺寸、临床相关对照和制造可行性。

11 Conclusions：CS基可注射水凝胶作为微创骨再生系统具潜力；生理条件下原位成胶可填充不规则骨缺损，优于预成型植入物。天然CS有局限，但交联策略和纳米材料/生物活性陶瓷复合显著改善完整性。未来需提高承重性能接近天然骨并保持可注射性；标准化体内模型尤其生物膜感染骨不连等复杂病理对验证疗效关键；CS水凝胶与三维打印和实时生化传感器结合有望转化为个性化自适应骨科治疗。