《Frontiers in Oncology》：Xiaoai Jiedu recipe promotes NLRP3 inflammasome activation by alleviating PINK1-mediated mitophagy in hepatocellular carcinoma
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背景：消癌解毒方（XJR）是一种传统中药复方，已临床应用于肝癌的治疗。XJR展现出良好的抗肿瘤潜力，可能为肿瘤干预提供新策略。本研究旨在探讨XJR治疗肝细胞癌（HCC）的分子机制。方法：体内实验采用HCC异种移植小鼠模型，体外实验采用HepG2细胞。采用酶联免
背景：消癌解毒方（XJR）是一种传统中药复方，已临床应用于肝癌的治疗。XJR展现出良好的抗肿瘤潜力，可能为肿瘤干预提供新策略。本研究旨在探讨XJR治疗肝细胞癌（HCC）的分子机制。方法：体内实验采用HCC异种移植小鼠模型，体外实验采用HepG2细胞。采用酶联免疫吸附测定（ELISA）、免疫组织化学（IHC）、免疫荧光（IF）、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和蛋白印迹（Western blot）检测PTEN诱导推定激酶1（PINK1）介导的线粒体自噬和NOD样受体蛋白3（NLRP3）炎症小体激活。使用DCFH-DA和MitoSOX探针检测细胞线粒体活性氧（ROS）水平。使用透射电子显微镜（TEM）和JC-1染色观察XJR干预HCC过程中线粒体形态与功能以及线粒体膜电位（MMP）。结果：XJR通过上调血清和HepG2细胞中相关炎症因子水平显著促进细胞焦亡。观察到关键靶点包括PINK1、parkin、p62、LC3B、TOMM20、COX IV、NLRP3、ASC、GSDMD、caspase1、IL-1β和IL-18。XJR破坏了PINK1介导的线粒体自噬，从而增加线粒体ROS水平并在体内外促进NLRP3炎症小体组装。同时，使用通路特异性抑制剂和siRNA介导的敲低实验进一步表明，XJR通过抑制PINK1/parkin信号通路来抑制线粒体自噬并增强NLRP3炎症小体激活。结论：本研究初步结果表明，XJR可能减轻PINK1介导的线粒体自噬并激活NLRP3信号通路，从而在HCC中发挥抗肿瘤作用。
肝细胞癌（HCC，占原发性肝癌约90%）起病隐匿，多数患者确诊时已处于晚期，且复发率和死亡率高，目前化疗、放疗、免疫治疗等常规手段常受限于多药耐药、肿瘤复发和不良反应，临床迫切需要明确HCC发病机制并开发新治疗策略。线粒体自噬（mitophagy，细胞选择性清除受损线粒体的自噬过程）在HCC中具有促癌与抑癌的双重作用；NOD样受体蛋白3（NLRP3）炎症小体作为代谢相关危险信号的转导枢纽，参与炎症因子成熟和线粒体功能调控，与HCC进展密切相关。PTEN诱导推定激酶1（PINK1）/parkin通路是调控线粒体自噬的关键信号轴，已有研究显示抑制PINK1/parkin介导的线粒体自噬可增强NLRP3炎症小体激活，从而抑制HCC细胞增殖。消癌解毒方（XJR）是临床用于肝癌治疗的传统中药复方，既往研究证实其可通过AKT/mTOR通路和miR-200b-3p/Notch1轴抑制HCC细胞增殖，但其是否通过调控线粒体自噬与NLRP3炎症小体之间的串扰发挥抗肿瘤作用，尚不明确。基于此，研究人员开展本研究，旨在阐明XJR抗HCC的分子机制。
研究人员采用H22细胞皮下接种BALB/c-nu裸鼠建立HCC异种移植模型，以HepG2细胞为体外模型，并制备XJR含药血清进行干预。主要技术方法包括：酶联免疫吸附测定（ELISA）检测血清和细胞上清中炎症因子水平；免疫组织化学（IHC）和免疫荧光（IF）评估蛋白表达与定位；实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）和蛋白印迹（Western blot）检测mRNA和蛋白表达；透射电子显微镜（TEM）观察线粒体超微结构；JC-1探针检测线粒体膜电位（Δψ
m）；DCFH-DA和MitoSOX荧光探针检测细胞内及线粒体活性氧（ROS）。机制研究中，分别使用NLRP3抑制剂MCC950、自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）以及PINK1-siRNA转染，验证NLRP3炎症小体的必要性、自噬的参与及PINK1的介导作用。细胞系购自中国科学院上海细胞库，动物由南京青龙山动物养殖中心提供。
研究结果显示：3.1 XJR的体内抗肿瘤效率：通过H&E染色、Ki67免疫组化和TUNEL凋亡检测发现，XJR干预后肿瘤组织出现明显结构损伤、坏死、核固缩，Ki67表达降低，凋亡细胞增加，表明XJR在体内显著抑制HCC生长。3.2 XJR通过促进NLRP3炎症小体激活调节HCC炎症反应：ELISA结果显示XJR提高小鼠血清和HepG2细胞上清中IL-1β和IL-18水平，LDH释放增加，提示细胞焦亡（pyroptosis，一种炎性程序性细胞死亡）；Western blot和IHC显示NLRP3、ASC、GSDMD、caspase-1、IL-1β、IL-18等蛋白表达上调，mRNA水平也相应增加，说明XJR激活NLRP3炎症小体及其下游信号。3.3 XJR在HepG2细胞中上调NLRP3信号通路：使用NLRP3抑制剂MCC950预处理后，XJR诱导的TUNEL阳性细胞减少，IL-1β/IL-18水平及NLRP3通路蛋白和mRNA表达均被逆转，表明NLRP3炎症小体激活参与XJR的抗HCC作用。3.4 XJR在体内抑制线粒体自噬并诱导线粒体功能障碍：IHC显示PINK1和parkin表达在XJR组降低，p62和LC3B表达升高；TEM观察到线粒体肿胀、嵴溶解、外膜破裂等损伤；RT-qPCR和Western blot证实PINK1、parkin、LC3B表达下降，p62、COX IV、TOMM20表达上升，表明XJR抑制PINK1/parkin介导的线粒体自噬并导致线粒体功能障碍。3.5 XJR减弱PINK1介导的线粒体自噬并干扰HepG2细胞中的线粒体ROS：自噬抑制剂3-MA联合XJR进一步增加TUNEL阳性率、ROS水平，降低线粒体膜电位Δψ
m，并减少自噬体形成；免疫荧光和蛋白检测显示XJR降低PINK1、parkin和LC3B表达，升高p62及NLRP3通路蛋白，提示XJR具有类似3-MA的抑制线粒体自噬作用，并由此促进NLRP3炎症小体激活。3.6 抑制PINK1介导的线粒体自噬参与XJR的体外抗HCC作用：PINK1-siRNA敲低PINK1后，XJR诱导的凋亡、ROS积累和NLRP3炎症小体激活进一步增强，同时线粒体自噬标志物降低，说明XJR通过抑制PINK1依赖性线粒体自噬来激活NLRP3炎症小体。
讨论部分指出，线粒体自噬在HCC发生发展中呈双重功能，抑制PINK1/parkin介导的线粒体自噬可导致受损线粒体堆积、ROS和线粒体DNA释放，进而激活NLRP3炎症小体，促进caspase-1依赖的细胞焦亡，从而抑制肿瘤增殖。NLRP3炎症小体在HCC中具有阶段依赖性作用：早期抑制肿瘤发生，晚期则可能促肿瘤；本研究结果支持XJR通过激活NLRP3炎症小体发挥抗肿瘤作用。同时，研究人员也指出局限性，如3-MA是广谱自噬抑制剂而非选择性线粒体自噬抑制剂，PINK1敲低外还需过表达回复实验，未进行线粒体自噬流检测，以及仅使用了单一种细胞系和单一动物模型，未来需进一步验证。研究结论：综上所述，本研究发现XJR通过抑制PINK1依赖性线粒体自噬激活NLRP3炎症小体，从而抑制HCC进展，为XJR抗HCC作用提供了新的机制见解；未来应进一步探讨XJR与NLRP3相关线粒体自噬、氧化应激和细胞焦亡之间的调控网络。
