基于网络药理学、机器学习与体外实验验证的青蒿素抗胃癌机制研究：ERK/MAPK通路及细胞周期相关靶点TOP2A/CCNB2/CCNA2

《Frontiers in Oncology》：Exploring the potential mechanism of artemisinin against gastric cancer based on network pharmacology, machine learning and experimental validation

　　

背景：青蒿素是从黄花蒿（Artemisia annua）中提取的天然活性成分，具有潜在抗胃癌（gastric cancer, GC）活性；然而，其具体靶点和分子机制仍不清楚。方法：采用网络药理学（network pharmacology）预测青蒿素的潜在靶点。进行差异表达分析和加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis, WGCNA）以识别胃癌相关基因。将上述数据集取交集获得青蒿素抗胃癌的候选靶点。进一步采用三种机器学习算法，即随机森林（random forest）、LASSO回归（least absolute shrinkage and selection operator regression, LASSO）和支持向量机-递归特征消除（support vector machine-recursive feature elimination, SVM-RFE）筛选核心靶点，随后进行分子对接（molecular docking）评估青蒿素与核心靶点的结合亲和力。最后，通过体外实验（细胞计数试剂盒-8（CCK-8）、EdU（5-乙炔基-2′-脱氧尿苷）、克隆形成、Transwell和蛋白质印迹（Western blot））验证抗胃癌作用及机制。结果：共鉴定出27个青蒿素抗胃癌候选靶点。三种机器学习算法交叉筛选最终确定TOP2A、CCNB2和CCNA2为核心靶点。分子对接显示青蒿素与这三个靶点之间的结合能较低（均低于?5.0 kcal/mol），提示潜在结合亲和力。体外实验证明，青蒿素显著下调三个靶点的mRNA表达水平，并抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭。机制研究表明，青蒿素处理降低p-ERK水平，且青蒿素抗胃癌作用可被ERK通路激活剂C16-PAF部分逆转。结论：体外研究显示，青蒿素抑制ERK/MAPK通路激活并降低细胞周期相关TOP2A、CCNB2和CCNA2的mRNA表达，导致胃癌细胞增殖、迁移和侵袭受抑制。

胃癌（gastric cancer, GC）是全球第五常见恶性肿瘤和第三大癌症死亡原因。尽管部分地区因公共卫生和饮食改变使发病率下降，但预计到2030年全球新发GC可达110万例。胃腺癌占GC多数，早期常无症状，确诊时多已晚期，晚期5年生存率低于30%；手术、化疗和靶向治疗仍受毒性高、耐药和晚期疗效有限等限制，因此亟需有效替代或辅助治疗策略。中药是药物发现的重要来源，青蒿素（artemisinin）是从黄花蒿（Artemisia annua L.）提取的天然活性成分，最初作为抗疟药，近年发现具有抗肿瘤活性；多项研究表明青蒿素及其衍生物可抑制胃癌细胞增殖、缩小肿瘤体积、诱导细胞周期阻滞，并通过PI3K/Akt和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）等信号通路抑制上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）和转移。然而其具体分子机制仍不清楚。鉴于常规化疗毒性较大，天然产物安全性相对较好，鉴定青蒿素抗胃癌靶点有助于低毒治疗策略。基于此，研究人员采用网络药理学（network pharmacology）预测青蒿素潜在靶点，结合差异表达分析和加权基因共表达网络分析（WGCNA）识别胃癌相关基因，取交集获得候选靶点；再用随机森林、LASSO回归和支持向量机-递归特征消除（SVM-RFE）三种机器学习算法筛选核心靶点，以分子对接评估结合亲和力，最后通过体外实验验证。研究得出青蒿素体外抑制细胞外信号调节激酶/丝裂原活化蛋白激酶（ERK/MAPK）通路激活并下调TOP2A、CCNB2和CCNA2的mRNA，抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭；该研究为青蒿素抗胃癌应用提供实验和理论支持，并展示“网络药理学—机器学习—实验验证”策略的可行性。

关键技术方法：研究基于公共RNA-seq队列（UCSC Xena，624例：414例肿瘤、210例正常；整合TCGA、GTEx等），采用HERB、PubChem、Swiss Target Prediction和SuperPred检索/预测青蒿素靶点；以limma进行差异表达分析，以WGCNA识别胃癌相关模块；取交集得候选靶点后，用STRING、Cytoscape及CytoHubba构建和分析蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI）网络，并行基因本体（Gene Ontology, GO）/京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）富集；以随机森林、LASSO回归和SVM-RFE筛选核心靶点；用AutoDock Tools进行分子对接；体外以SGC7901和SNU-5细胞行定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）、Western blot、CCK-8、EdU、克隆形成和Transwell实验；并用UALCAN、GEPIA、TCGA-STAD、HPA、TIMER2.0验证表达、预后和免疫浸润。

研究结果：
Identification of artemisinin targets and gastric cancer-related genes：从HERB、Swiss Target Prediction和SuperPred获得550个青蒿素相关靶点；limma分析得到2892个差异表达基因（DEGs，1371个上调、1521个下调）；WGCNA以β=4构建网络并识别11个模块，蓝色模块含1201个基因且与GC相关性最高（r=0.91，p<0.001）；该模块与DEGs交集得507个胃癌相关基因，再与550个青蒿素靶点交集得27个候选靶点。
GO and KEGG enrichment analysis of potential targets of artemisinin against gastric cancer：27个候选靶点显著富集于细胞周期G2/M期转换、周期蛋白依赖性蛋白激酶活性调节、细胞周期和p53信号通路等，提示青蒿素可能通过调控细胞周期发挥抗胃癌作用。
Machine learning for hub target identification：以STRING构建PPI网络（置信度0.15），CytoHubba的MCC、MNC和Degree三种拓扑算法交集得7个候选基因；随机森林、LASSO回归和SVM-RFE三种机器学习算法交集最终确定TOP2A、CCNB2和CCNA2为核心靶点。
Construction of the “disease–compound–target–pathway” network：构建“疾病—化合物—靶点—通路”网络，包含青蒿素、胃癌、27个靶点和7条通路；TOP2A、CCNB2和CCNA2节点度分别为12、24和18，处于网络中心位置。
Validation of hub target expression in gastric cancer：UALCAN和TCGA-STAD数据均显示TOP2A、CCNB2和CCNA2在胃癌组织中显著高表达；HPA数据库显示三者蛋白在胃腺癌组织中高表达；Kaplan–Meier生存分析未显示其表达与胃癌患者总生存期（overall survival, OS）有显著统计学关联。
GSEA analysis of hub target genes：按各核心基因表达中位数分组进行基因集富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA），高表达组显著富集于E2F_TARGETS、G2M_CHECKPOINT、MITOTIC_SPINDLE、MYC_TARGETS_V1/V2和MTORC1_SIGNALING等细胞周期、增殖和代谢相关通路。
Immune cell infiltration analysis：基于TIMER2.0分析，三个核心靶点表达与多数免疫细胞浸润水平显著负相关，尤其与CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞和巨噬细胞相关。
Molecular docking validation：分子对接显示青蒿素与TOP2A、CCNB2和CCNA2的结合能分别为?6.83、?7.30和?6.87 kcal/mol，均低于?5.0 kcal/mol；结合模式涉及氢键、疏水作用和π-烷基作用，提示潜在结合亲和力。
Artemisinin downregulates the expression of hub targets：qRT-PCR显示青蒿素处理显著下调SGC7901和SNU-5细胞中TOP2A、CCNB2和CCNA2的mRNA表达；Western blot显示青蒿素降低Ki-67、Vimentin、MMP2、MMP9和p-ERK水平，总ERK无明显变化；功能实验所用浓度为SGC7901 150 μM、SNU-5 200 μM。
Artemisinin suppresses the proliferative capacity of gastric cancer cells：CCK-8显示青蒿素以时间和剂量依赖方式抑制细胞活力；EdU染色显示EdU阳性细胞比例显著降低；克隆形成实验显示集落大小和数量显著减少，表明青蒿素抑制胃癌细胞增殖和克隆形成能力。
Artemisinin suppresses the migration and invasion abilities of gastric cancer cells：Transwell迁移实验显示穿膜细胞数显著减少；Matrigel预包被Transwell侵袭实验显示穿透Matrigel的细胞数显著减少，表明青蒿素抑制胃癌细胞迁移和侵袭。
Artemisinin exerts anti-gastric cancer effects by regulating hub targets via the ERK/MAPK pathway：使用ERK通路激活剂C16-PAF进行 rescue 实验，C16-PAF部分逆转青蒿素对EdU阳性细胞比例、克隆形成、迁移和侵袭的抑制作用，并恢复p-ERK及Ki-67、Vimentin、MMP2/9表达；提示ERK/MAPK通路参与介导青蒿素抗胃癌作用，且青蒿素处理伴随TOP2A、CCNB2和CCNA2下调。

讨论部分总结：青蒿素抗胃癌活性已有报道，但其具体靶点和机制不清。传统网络药理学多依赖PPI网络拓扑参数筛选核心靶点，可能忽略基因在疾病状态下的判别能力；本研究将随机森林、LASSO回归和SVM-RFE引入靶点筛选，建立“网络拓扑+特征选择”双层策略，以减少单一算法导致的假阳性或假阴性。TOP2A、CCNB2和CCNA2均为细胞周期调控分子：TOP2A编码DNA拓扑异构酶IIα，参与DNA复制、染色体凝缩和姐妹染色单体分离；CCNA2和CCNB2分别为周期蛋白A2和B2，作为CDK激酶的调节亚基参与S期至G2期及G2/M期转换；三者可形成连续调控轴。三者在胃癌中高表达，GSEA高表达组富集于E2F_TARGETS和G2M_CHECKPOINT等通路，支持其通过加速细胞周期促进胃癌进展。生存分析未见显著OS关联，可能因细胞周期基因主要调控增殖活性、对长期预后直接影响有限，且TCGA胃癌患者临床异质性可能掩盖生存关联。分子对接结合能较低，并与既往报道的参考化合物结果进行比较；结合模式中氢键、疏水和π-烷基作用多样，为多靶点结合提供结构基础。qRT-PCR和功能实验在转录及功能层面验证了网络药理学预测。免疫浸润分析显示三基因表达与CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞和巨噬细胞浸润负相关，提示可能与免疫抑制性肿瘤微环境有关，但因果关系需进一步验证。ERK/MAPK通路在约40%—60%胃癌患者中异常激活；本研究中青蒿素降低p-ERK而不改变总ERK，C16-PAF部分逆转其抗增殖、抗迁移和抗侵袭作用并恢复下游蛋白表达，提示ERK/MAPK是主要介导通路之一，但其他平行通路可能参与。Gravett et al.曾报道青蒿素及其衍生物的抗增殖作用在不同肿瘤细胞系间差异较大，支持本研究所用较高浓度；但高浓度可能带来脱靶效应，而p-ERK特异性下降、三个靶点mRNA下调和C16-PAF部分逆转支持其作用至少部分通过ERK/MAPK—细胞周期轴。研究局限包括：缺乏体内动物模型验证；仅检测三个靶点mRNA而未检测蛋白表达；分子对接为理论预测，未进行CETSA、SPR、DARTS或ITC等生物物理结合实验；ERK通路与三个核心基因之间的直接因果调控尚未证实。

结论翻译：本研究通过整合网络药理学、机器学习、分子对接和体外实验，研究人员发现青蒿素抑制ERK/MAPK信号通路激活并下调细胞周期相关TOP2A、CCNB2和CCNA2的mRNA水平，这与胃癌细胞增殖、迁移和侵袭受抑制相关。这些发现仅限于体外模型，在就青蒿素抗胃癌疗效作出转化性结论前需要小鼠异种移植模型。ERK通路与三个核心基因之间的直接因果调控需要进一步实验验证。分子对接提示青蒿素与上述靶点具有潜在结合亲和力。本研究为青蒿素在胃癌治疗中的应用提供了实验和理论支持，也证明了“网络药理学—机器学习—实验验证”整合策略用于研究天然产物机制的可行性。