基于NaDES基超声辅助提取及RSM与ANN优化Pistacia lentiscus L.果实pH响应型生物活性花青素提取物

《Sustainable Food Technology》：Artificial neural network- and RSM-tailoring pH-responsive and bioactive anthocyanin extracts from Pistacia lentiscus L. fruits utilizing NaDES-based ultrasound-assisted extractionOpen Access

　　

花青素因其强着色能力、低毒性及潜在健康促进作用，已被广泛认为是食品、化妆品和制药工业中合成着色剂的有前景替代品。然而，由于花青素对环境条件敏感，且传统提取技术存在局限，从天然来源中提取并稳定花青素仍具挑战性。在本研究中，研究人员考察了超声辅助提取（UAE）联合天然低共熔溶剂（NaDESs）作为从Pistacia lentiscus果实中回收花青素的绿色策略。目标在于获得一种易于获得且稳定的富含花青素提取物，适合直接掺入多种配方。在此框架下，研究人员比较评估了不同绿色溶剂的花青素得率和pH响应行为，其中氯化胆碱-乳酸表现出最佳综合性能；因此，选择该体系通过响应面法（RSM）和人工神经网络（ANN）建模进行提取优化。在优化条件下，提取物表现出较高的花青素和酚类含量，分别达到4.98–5.07 mg C3GE（矢车菊素-3-葡萄糖苷当量）g^?1样品和55.64–55.66 mg GAE（没食子酸当量）g^?1样品。提取物还表现出抗氧化能力和抗菌活性、显著量的黄酮类和单宁类，以及明显的pH依赖性颜色转变。高效液相色谱-光电二极管阵列检测（HPLC-PDA）分析显示飞燕草素和矢车菊素为提取物中的主要花青素苷元，并进一步评估了其稳定性。总体而言，基于NaDES的UAE代表了一种从P. lentiscus果实中获得pH响应型富含花青素提取物的可持续方法。所得提取物显示出作为天然着色剂和功能性成分掺入商业产品的潜力。

研究背景与目的：花青素（anthocyanins，水溶性类黄酮色素）因着色力强、毒性低及潜在健康促进作用，被视为食品、化妆品和制药领域合成着色剂的替代品，但其不饱和双键和易氧化基团导致化学不稳定，受酸碱、氧、热和光影响易降解。Pistacia lentiscus L.果实富含多酚、黄酮、鞣质和花青素，但传统提取存在耗时长、溶剂用量大、效率低及热降解等问题；常规有机溶剂毒性、挥发性和易燃性也限制应用。天然低共熔溶剂（NaDESs，由氢键供体和受体形成的绿色溶剂）与超声辅助提取（UAE，利用声空化促进传质的提取技术）结合，有望提高花青素回收率并改善稳定性。研究人员因此以NaDESs-UAE提取P. lentiscus果实花青素，比较响应面法（RSM，统计回归优化方法）与人工神经网络（ANN，机器学习非线性建模工具）优化性能，并表征提取物的pH响应性、抗氧化、抗菌及稳定性，以评估其作为天然着色剂和功能性成分的潜力。

关键技术方法概述：P. lentiscus果实采自塞浦路斯Limassol District的Pachna村（34°46′20.8″N 32°47′40.1″E），于成熟期采收并冻干。制备38种NaDES并以pH、黏度和ATR-FTIR表征；在UAE（35 kHz，250 W）中心点条件下筛选绿色溶剂，选定氯化胆碱-乳酸（ChCl-LA）。采用中心复合设计（CCD）考察提取时间、温度、液固比和NaDES含水量四因素，以总花青素含量（TAC）和总酚含量（TPC）为响应建立RSM；并构建4:7:2多层前馈ANN，结合k=5交叉验证和遗传算法（GA）优化。提取物以pH差分法、Folin-Ciocalteu法、AlCl₃比色法、香草醛-HCl法和KIO₃比色法分别测定TAC、TPC、总黄酮（TFC）、原花青素（TPAC）和水解单宁（THTC）；以DPPH（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl）和FRAP（ferric reducing antioxidant power）测抗氧化；HPLC-PDA测花青素苷元；微量肉汤稀释法测最低抑菌浓度（MIC）和半数抑制浓度（IC50）；并进行pH 1–14光谱及15天稳定性试验。

研究结果：
3.1 绿色溶剂筛选及pH响应特性：通过比较多种NaDESs和常规绿色溶剂的TAC及pH依赖性显色，发现ChCl-LA在NaDESs中TAC最高，且与乙醇水溶液和酸化乙醇水溶液统计相当；其提取物在pH 4–7范围内颜色变化清晰，故选为后续提取介质。
3.2 RSM优化提取参数：通过CCD四因素30次运行，TAC为2.0–5.4 mg C3GE g^?1样品、TPC为22.7–56.5 mg GAE g^?1样品；二阶多项式模型显著，TAC和TPC的R²分别为0.9462和0.9767，RMSE为0.204和1.213。
3.2.1 模型开发与统计评价：ANOVA表明模型显著、失拟不显著；提取时间、温度和水含量对TAC和TPC有显著线性影响，液固比不显著；TAC除温度二次项外多数二次项显著，TPC中液固比二次项不显著；TPC存在温度×液固比及液固比×水含量显著交互。
3.2.2 响应面分析：响应面显示提取时间和温度在适度范围内提高TAC和TPC，但过长或过高会引起平台或下降；水含量是最主要影响因素，液固比影响较弱；TPC交互作用较TAC明显。
3.2.3 最优提取参数确定与模型验证：采用期望函数多响应优化得40 min、40 °C、15 mL g^?1、40%水，预测TAC 5.2 mg C3GE g^?1样品和TPC 55.9 mg GAE g^?1样品，验证实验与预测偏差小。
3.3 ANN优化提取参数：基于CCD数据构建ANN模型并以GA优化，ANN对非线性关系建模良好。
3.3.1 ANN模型构建：4:7:2网络训练、验证和测试MSE分别为0.00182、0.0023和0.0038，R²分别为0.9676、0.9575和0.9034。
3.3.2 ANN-GA优化分析：经100代GA得39.1 min、39.1 °C、15.7 mL g^?1、39.6%水，预测TAC 5.2 mg C3GE g^?1和TPC 55.5 mg GAE g^?1；实验值5.1和55.5，误差1.9%和0.18%。
3.4 RSM与ANN优化方法比较：RSM对TAC预测略优（R²=0.9462，MSE=0.0029），ANN对TPC预测更优（R²=0.9815，MSE=0.0010）；两者最优条件相近，且NaDES-UAE的TAC和TPC均高于60%乙醇及ChCl-LA无超声搅拌提取。
3.5 优化提取物组成与性质：RSM和ANN优化提取物TAC为4.98±0.17和5.07±0.14 mg C3GE g^?1样品，TPC为55.66±0.78和55.64±0.35 mg GAE g^?1样品；TFC为7.27±0.23和5.64±0.10 mg CE g^?1样品，TPAC为102.68±0.96和84.74±0.62 mg CE g^?1样品，THTC为13.34±0.47和11.69±0.71 mg TAE g^?1样品；DPPH抑制率85.64±1.18%和86.04±0.55%，FRAP为358.31±4.40和294.85±5.79 μmol TE g^?1样品；HPLC-PDA仅检出飞燕草素（3.3±0.2 mg g^?1样品）和矢车菊素（1.9±0.1 mg g^?1样品），与Aissat et al.、Longo et al.等报道一致；TAC高于Chaabani et al. (2023)和Boudieb et al. (2019)报道，TPAC高于Yemmen et al.报道。
3.6 优化提取物pH响应特征：通过pH 1–14的UV-vis和肉眼观察，pH 1–3呈红色（flavylium阳离子），pH 4–7逐渐变色（醌式碱），pH>7发生结构重排和降解呈黄褐色；pH 4–7明显颜色变化提示其作为食品体系天然pH敏感指示剂的潜力。
3.7 提取物抗菌活性：微量肉汤稀释法显示所有测试菌株MIC为5%（v/v）；25%（v/v）时细菌抑制率36.7%–66.3%，以L. monocytogenes最高（66.3%），E. coli最低（36.7%）；酵母中C. albicans抑制74.2%、S. cerevisiae抑制68.0%；RSM与ANN提取物无显著差异，作者以细胞壁结构差异解释敏感性。
3.8 提取物花青素苷元稳定性：15天储存试验表明4 °C避光下稳定性较好，25 °C光照下降解较大；第15天25 °C光照下飞燕草素保留53.5%、矢车菊素保留60.9%，其余条件保留71.7%–76.9%；飞燕草素对储存条件略更敏感，ChCl-LA的氢键作用和酸性环境可能有助于稳定。

讨论总结与研究结论（译）：讨论部分表明，ChCl-LA NaDES与UAE联用可有效回收P. lentiscus果实花青素和多酚，RSM与ANN均能可靠预测优化条件，提取物兼具pH响应、抗氧化和抗菌功能；但研究仍处实验室规模，放大性能和工艺验证尚待确立，提取物在相关配方中的稳定性、适用性和表现需进一步研究，掺入食品包装配方是开发智能食品包装的前景。研究结论译：本研究证明UAE与NaDESs结合可从P. lentiscus果实中可持续回收花青素；在测试的绿色提取介质中，ChCl-LA NaDES在花青素回收和pH响应性方面最有利；RSM和ANN优化获得可靠预测模型，实验与预测吻合良好；优化提取物含大量目标花青素及黄酮类、原花青素和水解单宁等酚类亚类。优化条件下，RSM和ANN提取物TAC分别达4.98±0.17和5.07±0.14 mg C3GE g^?1样品，TPC分别达55.66±0.78和55.64±0.35 mg GAE g^?1样品；TAC超过此前常规有机溶剂提取报道，显示NaDES-UAE效率。提取物中TFC为7.3±0.2和5.6±0.1 mg CE g^?1样品，TPAC为102.7±1.0和84.7±0.6 mg CE g^?1样品，THTC为13.3±0.5和11.7±0.7 mg TAE g^?1样品，多数超过文献报道。HPLC-PDA显示飞燕草素（3.3±0.2 mg g^?1）和矢车菊素（1.9±0.1 mg g^?1）为主要色素；不同pH下明显颜色转变显示其作为食品相关体系天然pH敏感指示剂的应用潜力；提取物还具有显著抗氧化能力和对食源性细菌及酵母的抗菌活性。主要成就是开发了新型绿色提取策略，高效回收花青素和酚类并获得具抗氧化、抗菌和pH响应性的稳定提取物，可作为活性和功能性成分直接掺入多种配方。研究为实验室规模，放大性能待确立；未来应关注放大和工艺验证，并进一步研究提取物在相关配方中的稳定性、适用性和性能；将其掺入食品包装配方是开发新型智能食品包装的前景。总体而言，该方法可促进未充分利用农产品的可持续增值及其在创新食品包装中的应用。