新型噻唑–对乙酰氨基酚杂合物的设计、合成与COX-1/2双重抑制及免疫调节评价：构效关系、体外生物学与分子对接研究

《RSC Advances》：Innovative design and development of novel thiazole–paracetamol hybrids as COX inhibitors and immunomodulatory activity: design, synthesis, SAR, in vitro biological evaluation, and molecular docking analysisOpen Access

　　

采用分子杂交策略，基于对乙酰氨基酚与噻唑衍生物偶联设计单一药效团，得到噻唑–对乙酰氨基酚杂合衍生物4–11；这些衍生物利用腙（–C═N–NH）和偶氮（–N═N–）连接子，作为氢键供体/受体结合位点。所设计衍生物的结构经分析数据（红外（IR）、¹H核磁共振（NMR）和¹³C核磁共振（NMR））及元素分析充分表征并确认。采用体外环氧合酶-2（COX-2）酶抑制实验评价合成杂合物的抗炎潜力。化合物表现出中等至优异的COX-2抑制活性，半数抑制浓度（IC₅₀）为0.81–7.27 μM，与塞来昔布（IC₅₀ = 0.62 ± 0.02 μM）比较。合成衍生物中，5-乙酰基-4-甲基噻唑候选物8成为最强效抑制剂，IC₅₀值为0.81 ± 0.02 μM，而5-乙氧羰基-4-甲基噻唑衍生物7也表现出显著活性（IC₅₀ = 1.35 ± 0.15 μM）。构效关系（SAR）分析显示，4-甲基噻唑骨架比相应4-氧代-4,5-二氢噻唑骨架更有利于COX-2抑制，而在C-5位引入紧凑的含羰基取代基显著增强抑制效力。相反，芳族取代或引入4-氧代-4,5-二氢噻唑环降低活性。此外，化合物7和8表现出低微摩尔环氧合酶-1（COX-1）抑制活性（IC₅₀ = 0.89 ± 0.05和0.72 ± 0.02 μM），证明对COX-1/2抑制具有双重活性。另外，化合物8有效抑制肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）产生，IC₅₀值分别为1.48 ± 0.50和1.80 ± 0.35 μM，显示出与塞来昔布（IC₅₀ = 1.40 ± 0.10和1.74 ± 0.20 μM）相当的抑制活性。最有前景衍生物8的对接过程显示强结合亲和力及多种相互作用，包括氢键、π–π堆积和疏水相互作用（π-烷基和烷基）。此外，吸收、分布、代谢、排泄和毒性（ADMET）预测表明良好的药代动力学特征和可接受的毒性水平。这些发现确定化合物8为开发具有双重环氧合酶抑制和免疫调节特性的下一代抗炎剂的有前景先导候选物。

研究背景与问题：炎症是免疫系统识别微生物入侵、细胞损伤或有害因子后启动的多环节动态反应，急性炎症有助于组织修复，慢性炎症与心血管疾病、糖尿病、神经退行性疾病及多种恶性肿瘤相关。炎症介质包括TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎细胞因子以及COX和LOX通路生成的前列腺素和白三烯。COX-1为组成型表达，维持胃肠细胞保护和肾脏稳态；COX-2为诱导型，介导前列腺素依赖的疼痛、发热和炎症。传统非选择性非甾体抗炎药（NSAIDs）同时抑制COX-1/2，虽有效但可致胃肠溃疡、肾功能障碍和心血管毒性；选择性COX-2抑制剂（coxibs）改善胃肠安全性，但仍与心血管事件风险相关，valdecoxib和rofecoxib因心血管血栓事件撤市。因此需要兼具疗效和安全性、并可能具有免疫调节作用的新型抗炎化合物。噻唑是优势杂环，存在于利托那韦、鲁拉西酮、磺胺噻唑、硫胺素等药物或天然产物中，具抗炎、抗癌、抗糖尿病、抗菌、抗病毒等多种活性；对乙酰氨基酚安全性较好但外周抗炎作用有限；腙和偶氮连接子可提供氢键供体/受体并影响电子沟通。基于分子杂交策略，研究人员将对乙酰氨基酚与噻唑经腙/偶氮连接子偶联，设计合成衍生物，以期同时评价COX抑制和炎症细胞因子调控。研究开展与结论：研究人员合成并表征系列噻唑–对乙酰氨基酚杂合物，进行体外COX-2抑制、重点化合物COX-1抑制、TNF-α/IL-6抑制、SAR分析、ADMET/毒性预测及分子对接。结果表明化合物8（5-乙酰基-4-甲基噻唑）为最强COX-2抑制剂，7次之；7/8为低微摩尔双重COX-1/2抑制剂；8抑制TNF-α/IL-6与塞来昔布接近；ADMET和毒性预测总体有利；对接显示稳定结合。该研究为下一代兼具COX抑制和免疫调节的抗炎先导提供依据。关键技术方法（不超过250字）：化学合成采用对氨基苯乙酮重氮化后与对乙酰氨基酚偶联得2，再与缩氨基硫脲缩合得3；3与α-氯代羰基化合物等环化得4–8，与丁炔二酸二乙酯、4-氟苯甲酰溴、2-氯-N-(对甲苯基)乙酰胺等反应得9–11；结构经IR、¹H NMR、¹³C NMR和元素分析确认。生物评价采用COX-2/COX-1抑制剂筛选试剂盒和ELISA试剂盒；计算采用SWISSADME、PROTOX3和Vina对接COX-2（PDB: 3NL1），Discovery Studio/PyMOL可视化；未涉及临床或动物样本队列。

研究结果：2.1 Chemistry and characterization（化学与表征）：通过重氮化偶联、缩合及α-氯代羰基环化等反应合成2–11；IR、¹H NMR、¹³C NMR和元素分析确认结构，得到4-甲基噻唑、5-乙酰基-4-甲基噻唑、4-氧代-4,5-二氢噻唑、4-芳基/氨基芳基噻唑等系列。2.2 Biological evaluation（生物学评价）：对合成衍生物进行体外COX-2抑制及重点化合物COX-1、细胞因子评价。2.2.1 In vitro cyclooxygenase-2 enzymatic assay（体外COX-2酶实验）：100 μM初筛抑制率60.82%–76.32%，7和8分别为75.24%和76.32%，接近塞来昔布77.35%；IC₅₀为0.81–7.27 μM，8最强（0.81±0.02 μM），7为1.35±0.15 μM，5最弱（7.27±0.11 μM）。2.2.2 Structure–activity relationship（构效关系）：噻唑C4/C5取代影响活性；2（4.47）到3（2.31）再环化为噻唑可改善；4-甲基噻唑优于4-芳基/氨基芳基；C5乙酰（8）和乙氧羰基（7）增强，4-氧代降低（5为7.27，6为3.15），9为2.70，10为3.70，11为3.95。2.2.3 COX-1 activity and selectivity index（COX-1活性与选择性指数）：7和8的COX-1 IC₅₀为0.89±0.05和0.72±0.02 μM，选择性指数（SI）0.66和0.88，塞来昔布SI1.23；提示7偏向COX-1，8为双重COX-1/2抑制。2.2.4 TNF-α and IL-6：ELISA显示8对TNF-α和IL-6抑制率约95%和97%，IC₅₀为1.48±0.50和1.80±0.35 μM，与塞来昔布1.40±0.10和1.74±0.20 μM接近。2.3 Theoretical studies（理论研究）：ADMET和毒性预测评价8。2.3.1 In silico ADMET prediction study（计算机ADMET预测）：8分子量450.51 g mol^?1，可旋转键8，Csp³分数0.18，共识log P 3.89；符合Lipinski（仅TPSA一项违反）和Ghose，Veber因TPSA>140一项违反；非P-gp底物，不能透BBB，皮肤渗透log K_p ?6.11 cm s^?1，低胃肠吸收，有一个因偶氮的PAINS警报，合成可及性3.81；总体药代特征有利。2.4 In silico toxicity prediction（计算机毒性预测）：8为class III，预测LD₅₀ 300 mg kg^?1；对乙酰氨基酚和塞来昔布为class IV（338和1400 mg kg^?1）；8预测肝毒性0.51、肾毒性0.52，无神经、呼吸、心脏毒性；免疫毒性、致突变、细胞毒、BBB毒性、生态、临床和营养毒性均不活跃，仅致癌性0.53；总体安全性优于参照。2.4.1 In silico molecular docking simulation（计算机分子对接）：8对接COX-2（PDB: 3NL1）结合能?15.35 kcal mol^?1，塞来昔布再对接?14.719 kcal mol^?1；8与Glu510形成氢键，苯环与His75 π–π堆积、与Val509烷基作用，噻唑与Val102、Leu517、Val335、Ile331、Leu345、Leu103等发生烷基/π-烷基作用，硫与Met521、Met99发生π-硫作用，乙酰苯甲酮甲基与Val102、Leu517、Leu103作用，苯环与Ala513发生π-烷基作用；提示稳定复合物。

讨论与结论翻译：作者在“Structural optimization and biological investigation: future perspectives”中认为，将噻唑经腙连接子引入对乙酰氨基酚是靶向COX酶的新型抗炎分子设计策略；SAR显示4-甲基噻唑、4,5-二氢-4-氧代噻唑、4-芳基噻唑和4-(氨基芳基)噻唑等结构变化直接影响COX-2抑制，活性主要受取代基电子性质、疏水性和位阻调控。7和8的强效可能与4-甲基噻唑C-5位吸电子基（乙酰、乙氧羰基）有关。未来可进行噻唑生物等排修饰、与不同卤代试剂反应、N-芳基缩氨基硫脲、以1,3,4-噻二唑替代噻唑，并扩展NO、mPGES-1、PGE2、iNOS、IL-1β、IL-10、IL-17、ROS/Nrf2/HO-1及细胞和动物模型、药代和毒理研究。结论翻译：本研究在单一杂合框架内合成了新型对乙酰氨基酚偶联噻唑系列，涵盖4-甲基噻唑、4-氧代噻唑和4-取代氨基或芳基噻唑。噻唑–对乙酰氨基酚衍生物4–11的COX-2抑制IC₅₀低于10 μM，范围为0.81±0.02至7.27±0.11 μM，与塞来昔布（0.62±0.02 μM）比较；化合物8活性最强（0.81±0.02 μM），7为1.35±0.15 μM。SAR表明噻唑取代基性质显著影响COX-2抑制和活性位点结合。7和8的COX-1抑制IC₅₀为0.89±0.05和0.72±0.02 μM，提示低微摩尔双重COX抑制剂。8抑制TNF-α和IL-6的IC₅₀为1.48±0.5和1.80±0.35 μM，塞来昔布为1.40±0.1和1.74±0.2 μM。8的ADMET预测显示良好药代特征和安全性前景；对接显示其在COX-2活性位点稳定结合并具有多种相互作用，支持进一步优化为抗炎先导化合物。总体而言，该研究提示8有进一步优化和临床前研究价值，以开发更安全有效的抗炎药。