人iPSC来源工程心脏组织重现室性心动过速的触发与基质驱动机制

《Advanced Science》：Human Engineered Heart Tissues Reproduce Trigger- and Substrate-Driven Mechanisms of Ventricular Tachycardia

　　

人类诱导多能干细胞（iPSC）来源的工程心脏组织（EHTs）被用于模拟心脏生理和药物反应，但其是否能重现组织尺度室性心律失常机制仍不清楚。研究人员将改良的milliPillar EHT制备与高分辨率双通道电压/Ca²⁺光学标测相结合。基线电生理学显示，动作电位时程（APD）处于人心室报道的范围内，传导速度约为人纵向值的一半，并表现出APD和Ca²⁺瞬变时程的频率依赖性恢复、传导减慢以及生理性AP-Ca²⁺延迟。为探究室性心动过速（VT）的触发臂，研究人员在两个hiPSC系来源的EHTs中模拟了获得性长QT综合征（aLQTS；hERG阻断合并低钾/低镁）。aLQTS EHTs出现VT样发作，并伴有逐搏不稳定性。早后除极（EADs）异质性传播，产生触发活动、组织加速、APD离散、波裂和转子形成。这些事件短暂且自发终止（中位时间0.4秒），并聚集于头部/颈部区域弯曲处。为测试固定空间基质是否支持持续性折返，研究人员开发了一种可重复的局灶性冷冻损伤模型。损伤后，所有组织均出现VT样发作，其中70%在边界处出现解剖锚定转子；三个转子持续超过10秒，此为记录时间限制的下限。该分辨率的双电压/Ca²⁺标测确立了EHTs作为非动物平台，用于触发驱动和基质驱动的室性心律失常的机制研究。

室性心动过速（VT）及其退化为心室颤动（VF）是心脏性猝死的主要驱动因素。尽管动物模型和离体人心脏已广泛用于机制研究，但物种差异、人类遗传多样性以及疾病相关重塑可导致机制路径分歧，迫切需要基于人源组织尺度的平台来填补转化鸿沟。人诱导多能干细胞来源心肌细胞（hiPSC-CMs）虽可提供患者特异性电生理模型，但多数研究局限于单细胞、单层或类器官，缺乏结构各向异性、机械负荷和多细胞连接，难以再现维持持续性VT/VF所需组织尺度现象。工程心脏组织（EHTs）介于简化模型和完整心脏之间，可体现更生理的兴奋-收缩耦联（ECC），但高时空分辨率电生理记录仍受制备通量和稳定成像条件限制。本研究旨在建立高通量EHT制备和高分辨率双通道电压/Ca²⁺光学标测，系统验证EHTs能否重现组织尺度VT的触发与基质机制。论文发表在《Advanced Science》。

研究人员改良了开放式milliPillar平台：采用耐温树脂3D打印模具铸成聚二甲基硅氧烷（PDMS）模块，经电晕等离子处理和KnockOut血清替代物封闭后，组织自发脱离成功率达100%；1周组装成功率为79±9.3%。EHTs由约95%纯度的hiPSC-CMs与人心室成纤维细胞（Lonza）按3:1混合于胶原水凝胶制成，并使用两个hiPSC系（iPSC line 1：Gibco Episomal iPSC Line，A18945；iPSC line 2：Axol分化心肌细胞，AXCC-VC01）。培养约1月后，采用RH-237（30 μM）和Rhod-2 AM（10 μM）双染，在自建3D打印灌流台上进行同步光学标测，空间分辨率约22 μm，时间分辨率1 ms。通过点刺激和场刺激记录电压和Ca²⁺信号。aLQTS建模采用含2 mM K⁺、0.5 mM Mg²⁺并加500 nM E-4031的改良Tyrode液；局灶性冷冻损伤用液氮冷却的1 mm铜管接触左头实现。

**2.1 改良的milliPillar模块实现EHT可重复制造**：研究人员通过消除手动划痕步骤、优化PDMS表面处理，实现100%自发脱离；免疫染色显示心肌细胞纵向排列和成纤维细胞交错分布，肌节带清晰；BeatProfiler分析显示正性力-频率关系，表明1月龄EHT达到稳定、可重复的收缩表型。

**2.2 高分辨率电压/Ca²⁺同步光学标测系统的建立**：研发了3D打印灌流台，提供恒温、连续灌流和点刺激，同时减少漂浮运动伪影；双染料负载20分钟获得高信噪比信号；同步记录显示电压上升先于Ca²⁺瞬变，传导均匀。

**2.3 频率依赖性恢复曲线与快速AP-Ca²⁺耦联**：在1–3 Hz起搏下，APD80、纵向CV、CaD80和CaT衰减时间常数（Tau）均随周期长度（CL）缩短而降低，符合频率依赖性适应；1000 ms时APD80处于成人心室范围，而纵向CV约为人纵向值的一半；AP-Ca²⁺延迟为7.7±0.2 ms，接近成人水平，支持生理性ECC时程。

**2.4 对E-4031的药理学敏感性**：100 nM hERG阻断剂E-4031可重复延长APD80，验证了平台对药物反应的敏感性。

**2.5 在EHTs中模拟aLQTS**：在500 nM E-4031联合低K⁺/Mg²⁺条件下，1分钟内出现超出起搏频率的加速、逐搏间期变异增加和力变异性升高，提示VT样发作。

**2.6 光学标测解析aLQTS驱动的VT样表型**：aLQTS组织逐渐失去起搏捕获，出现APD80延长和更严重的区域梯度，舒张期间期（DI）缩短、dV/dt减慢；传导阻滞发生在APD延长和dV/dt降低区域。高分辨率频域标测显示局部频率升至2–2.5 Hz，并伴随相位奇点（PS）和转子形成；顺序三条件实验表明，仅联合条件可触发转子（6/6）。

**2.7 EADs的异质性传播及对功能性传导屏障的作用**：EADs出现三种表型：亚阈值（局限于起源）、衰减（局部传播但衰减）和完全传播（产生触发活动）；所有电压EAD均与Ca²⁺时程延长或二次驼峰同期出现，未观察到孤立舒张期Ca²⁺事件，提示非DAD介导；EADs常与APD离散和dV/dt降低区域共定位，既启动快速心律失常又促进传导屏障。

**2.8 加速、EADs与短寿命PS/转子的共同出现**：aLQTS中16/28个组织检测到PS（iPSC1 4/13，iPSC2 12/15），对照为0/27；PS中位持续时间约0.4 s，路径约1.9 mm；PS/转子富集于头部/颈部区域，且EADs在PS事件前出现，建立细胞触发到组织转子的时间联系。

**2.9 部分aLQTS EHTs中的VF样碎裂**：6/28个aLQTS组织出现短暂的多波阵面碎裂，2–3个波前与PS共存，呈VF样混沌信号，但很快恢复为较有序的VT样表型。

**2.10 局灶性冷冻损伤产生解剖锚定的折返基质**：10/10个冷冻损伤组织出现局限于左头的损伤区；冷冻后7/10组织出现PS（共62个事件），而对照仅1个短暂事件；其中22/62个转子超过1圈，3个持续超过10秒（受记录窗口限制）；转子轨迹集中于损伤边界，符合解剖锚定折返。

讨论部分指出，基线APD80和AP-Ca²⁺延迟落在成人心室范围内，但纵向CV约为成人纵向值的一半，这与残余的Cx43侧向分布及缺乏浦肯野纤维一致。aLQTS模型中，低K⁺/Mg²⁺单独不足以触发转子，仅联合高剂量E-4031才产生EAD驱动的触发活动和短寿命功能性转子，转子定位于头部/颈部解剖异质性区域。冷冻损伤则形成固定结构性障碍，在损伤边界锚定更持久的折返，部分转子稳定性接近人类持续性VF。结论：hiPSC来源的EHTs结合高分辨率光学标测，重现了成人心室范围内动作电位时程和约一半的纵向传导速度，并在定向扰动下重现了触发驱动和基质驱动的组织尺度室性心律失常机制；这使EHTs成为可扩展的非动物平台，用于机制性心律失常研究和临床前抗心律失常药物筛选，并可通过患者特异性hiPSC系扩展至基因-环境相互作用研究。