植物蛋白淀粉样纤维多态组装路径的流体动力选择

《Advanced Science》：Hydrodynamic Selection of Polymorphic Assembly Pathways in Plant Protein Amyloid Fibrils

　　

植物蛋白淀粉样纤维普遍在液体环境中组装，然而其形成过程常在不明确考虑流体运动作用的情况下被分析。在实际中，作为典型模型体系，大豆蛋白淀粉样纤维（SAFs）在涉及剪切和涡旋输运的动态流体动力条件下生成。此类流场如何调控纤维生长路径并产生多态组装仍很大程度上尚未被探索。在此，研究人员通过纳米级结构表征结合流场分析，阐明了SAFs组装路径的流体动力选择。原子力显微镜（AFM）识别出六种不同的纤维形态，包括短弯曲状、标枪状、环状、扭曲带状、螺旋带状和棒状结构。通过将AFM观察与粒子图像测速（PIV）结果整合，研究人员提出牵拉-接触-对接（DKD）动力学，作为理解多态纤维组装的一种合理流体动力模型。计算流体动力学（CFD）模拟进一步再现了实验观察流场的关键特征，并为所提出的纤维化路径解释提供流体动力支持。这些结果表明，深入理解多态组装路径中的流体动力选择行为对于为定制淀粉样材料的生产铺平道路具有重要意义。

该论文发表于《Advanced Science》。植物蛋白淀粉样纤维具有保守cross-β结构，较人病理淀粉样纤维无毒且营养有益，并具备抗氧化、乳化、凝胶、发泡和活性营养递送等功能；其功能多样性紧密关联于对纤维化条件高度敏感的多态结构。既往研究显示蛋白浓度、金属离子配位、同源种子、酶解和热处理均可调控纤维形成与形态，且水凝胶性能受纤维构筑单元形态支配。然而，蛋白纤维化本质上发生于液体环境并暴露于非平衡流体动力条件；搅拌和机械剪切可加速热展开、缩短滞后期，并通过纤维断裂和二次成核促进短纤维形成，剪切介导的成核物种从纤维表面脱附也可能导致多态分化。实际植物蛋白纤维化常在搅拌生成自由表面涡流场下酸性加热进行，但流场如何调控纤维生长路径并产生多态组装仍不清楚；传统策略还存在加工时间长、能耗高和转化效率有限等问题。因此，阐明涡流场中流体动力对多态组装路径的选择作用，对实现快速、节能和可控形成目标大豆蛋白淀粉样纤维（soy protein amyloid fibrils, SAFs）至关重要。研究人员在磁力搅拌自由表面涡流中系统研究大豆蛋白纤维化，将原子力显微镜（atomic force microscopy, AFM）与粒子图像测速（particle image velocimetry, PIV）及纳入表观粘度的计算流体动力学（computational fluid dynamics, CFD）模拟整合，建立连接涡流场与SAFs多态性和组装路径的机制框架。

关键技术方法：样本为东北农业大学农学院提供的成熟大豆（Dongnong-252，含水量11%），经等电点沉淀制备大豆分离蛋白（soy protein isolate, SPI，蛋白含量90.52%）；在pH 2.0、85°C、30 mg/mL下以0–1200 rpm磁力搅拌0–48 h进行纤维化。采用振荡流变、AFM（敲击模式，FiberApp分析）、透射电镜、Th T荧光、低场核磁共振与磁共振成像、傅里叶变换红外光谱、广角X射线散射（WAXS）、液相色谱-串联质谱（LC-MS）、超滤结合Lowry法的纤维转化率测定、PIV（2D2C-PIV，TiO₂示踪粒子）及CFD（VOF自由表面、拉格朗日粒子追踪、RNG k–ε湍流模型）。

2.1 SAFs的多态结构（Polymorphic Structures of SAFs）。通过自由表面涡流结合CFD、AFM/透射电镜和PIV，发现静置纤维平均高度0.5–2 nm，剪切下1.5–4 nm，平均内部轮廓长度随转速由约2398 nm降至约548 nm，提示静置滞后和剪切断裂限制伸长。AFM识别六种形态：短弯曲、标枪状、环状、扭曲带状、螺旋带状和棒状/纳米管状。短弯曲普遍；标枪状见于静置或低应力，强剪切可能促核化物种脱附而阻碍协同延长；环状仅在高转速600和1200 rpm出现，内径80–650 nm，PIV显示环形涡流、U形回流和射流，局部剪切几何影响曲率异质性；扭曲带和螺旋带在静置和剪切均见；棒状高度5–8 nm且无清晰周期性，提示不同路径。剪切流场与较少见的标枪状、环状和棒状多态体出现密切相关。

2.2 SAFs的拓扑重排（Topological Rearrangements of SAFs）。通过12和48 h长SAFs的AFM拓扑重建、扭转角自相关、PIV和流变，发现静态形成低高度单扭曲带或高刚度但周期性差的长刚性纤维，弱对流导致多竞争路径和多态异质。随转速升高，纤维高度增加、周期降低，结构刚性增强；但超过200 rpm（Re_max≈1345）后出现周期下降和部分断裂，提示失稳。PIV显示中等转速层流一致性好，随转速升高层流一致性恶化，故层流应变区是成熟长刚性SAFs的最佳机械窗口，且200 rpm长纤维增强水凝胶网络。早期核高度0.6–8.9 nm且拓扑异质，剪切调节核间碰撞；提出混沌成核和随机碰撞形成多态模板，再由空间拉链稳定。手性分析显示总体左手原纤维占优，适度剪切促进明确左手/右手物种和结构固结，过度剪切促手性衰减和拓扑重构；单扭曲带在剪切下平均螺距近静态三倍，提示适度剪切拉长螺距并降低周期波动；1200 rpm多数无手性纳米管状，指向低扭转挫曲热力学盆地。手性转换图识别四条汇聚至成熟右手扭曲带的路线，并首次在SAFs中识别四种可能转换路线，另见同一纤维左右手共存且周期高度波动的路线V。基于PIV/CFD，研究人员提出牵拉-接触-对接（drafting, kissing, and docking, DKD）模型：与翻滚交换不同，DKD在接触后保持轴向对齐并端对端对接，局部低压区介导牵拉、短暂接触和稳定对接，端对端疏水作用、长程静电排斥和持续线性应变剪切场稳定对接，实现高效延长成熟。

2.3 CFD模拟与纤维化路径（CFD Simulations and Fibrillation Pathways）。通过RNG k–ε模型CFD、频率扫描流变、阶段表观粘度和粒子轨迹，模拟再现实验流场，尤其中等转速相干涡核和湍流涨落空间受限。流变显示≤200 rpm溶胶向网络转变更早，>200 rpm时G′和G″显著更低，提示适度流场促网络快速形成；表观粘度由约15 h的0.1 Pa s升至约39 h的166.7 Pa s，热对流与黏性耗散耦合增强，粒子轨迹混乱。涡系统分湍流涡核、层流应变区和旋转边界层：层流区均匀线性应变促原纤维定向排列和端对端延长，符合DKD；边界层剪切梯度异质导致旋转变形和曲率再分布，解释环状SAFs可变曲率。局部湍流能量耗散率ε随转速增加，Kolmogorov长度η和时间τ_k降低，表明局部耗散增强和变形加快；高湍动能促机械断裂、曲率不稳定和结构无序，使纤维更短更无序。由此多态结果受流体动力应力大小和空间异质性关键调控。路径图谱归为短弯曲纤维、单体核延长后缠结的长纤维、寡聚核直接延长的长纤维和无定形聚集四条路径；单体核在HSFs下排列成细种子，再延长和缠结成多股成熟纤维，持续层流剪切稳定定向对接，而静态随机对流扰乱有序缠结；寡聚核直接形成较粗种子并连续轴向生长，静态下周期分布更宽；剪切通过能量重分布降低边缘暴露势垒并促进边缘闭合，稳定紧凑低周期结构；短弯曲纤维和无定形聚集在静态更易过度缠结或长大，剪切通过轴向应变和机械断裂抑制。剪切不引入全新路线，而选择性偏置现有路径网络中的能量流、对接方向和应变分布，作为路径选择器。

2.4 SAFs的构象重塑（Conformational Remodeling of SAFs）。通过FTIR Amide I区、Th T荧光、WAXS、LC-MS及低场核磁共振与磁共振成像，发现pH 2大豆蛋白主峰1632.45 cm^?1，β-sheet含量56.8%；静态12 h反平行β-sheet升高而平行降低，提示早期优先积累亚稳态反平行结构；剪切加速β-sheet形成，但最高反平行含量不随剪切强度成比例增加，提示高HSFs促β-strand形成而不利于反平行层间堆叠。12 h后平行β-sheet各条件均增加并伴随成熟，以α-螺旋/无规卷曲和部分β-turn减少为代价，1200 rpm平行/反平行比增加最快，说明强HSFs加速反平行向平行重排。Th T显示6 h后荧光增强数个数量级，较高转速更快；纤维转化率在200 rpm最高（82.33%±6%），更高转速下降。WAXS显示d₁（约4.5 ?）几乎不变，d₂由静态10.24 ?降至1200 rpm 9.22 ?，表明高HSFs增强层间空间拉链和更有利cross-β堆积。LC-MS显示各条件肽谱不同，600 rpm短肽比例最高、长肽最低且特有肽最多，提示中间剪切增强肽断裂并改变组成而非仅增加丰度；200 rpm生成最大总肽库但短肽和特有肽少于600 rpm，提示适度剪切促平衡水解。水状态分析显示肽结合水（T_2b）、聚集体间固定水（T₂₁）和类bulk自由水（T₂₂）变化，中等剪切下T_2b波动更强，静态和高剪切稳定氢键环境，高剪切下T₂₂下降更陡，反映更有效脱水或去湿。上述结果表明剪切促进从亚稳态反平行β-sheet向能量稳定平行cross-β架构的构象重塑，并伴随层间压实和增强脱水，最终形成层间距减小且热力学有利空间拉链堆积的SAFs。

讨论部分将剪切流场定位为结构选择主动调节者，而非被动加速器；其将成核层级、β-sheet重塑和脱水驱动堆积耦合为统一能量耗散框架，并强调存在最佳机械窗口，尤其层流应变区。研究结论翻译如下：植物蛋白淀粉样纤维化传统上被解释为热驱动自组装过程，其中搅拌主要加速展开并缩短滞后期。本研究结果修正这一范式，证明剪切流场作为结构选择的主动调节者，将成核层级、β-sheet重塑和脱水驱动堆积耦合为统一能量耗散框架。剪切流场并非均匀增强纤维化动力学，而是重新分配竞争聚集路径间的动力学分配，抑制局部缠结或无定形路径，同时促进定向延长和受控原纤维组织。在静态或弱对流条件下，异质成核事件共存，使亚稳态反平行β-sheet富集中间体积累，并产生结构柔性或不规则多态体。相反，稳定线性应变剪切区施加定向排列和碰撞偏置而不引起湍流断裂，从而引导组装朝向结构趋同纤维，其特征为周期降低和刚性增强。在分子尺度，剪切扰动β-strand排列动力学，加速从亚稳态反平行β-sheet构型向热力学有利平行cross-β架构转变。这种构象重塑伴随选择性层间压实，表现为层间距减小而链间氢键距离保持，表明剪切流场主要强化空间拉链样侧链互锁，而不是改变主链氢键几何。同时，低场NMR分析显示剪切下脱水和去湿转变加速，与稳定紧密堆积cross-β结构的界面水分子排出增强一致。这些观察共同支持剪切耦合构象压实机制，其中剪切流场(i)偏置成核相互作用，(ii)加速β-sheet重排，(iii)促进脱水介导的层间收紧，最终稳定能量最小化SAFs多态体。重要的是，过度剪切破坏层流排列并部分损害结构调控，强调存在多态选择的最佳机械窗口，尤其是在层流应变区。总体而言，这种多尺度整合确立流体动力剪切不是被动加速器，而是通过耦合构象和水合重塑调节淀粉样能量景观的统摄性物理参数。此流体动力选择原则可能扩展到其他蛋白基淀粉样体系，并为功能生物材料的机械调控提供启示。