《Frontiers in Marine Science》：Environmental occurrence of the algal morphogen thallusin and identification of Algoriphagus species as producers in the Baltic Sea (Kiel Fjord, Germany)
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海洋大型藻类的生长与发育依赖于与其相关联的细菌。在石莼属（Ulva）物种中，诸如thallusin等细菌形态发生素对于正常的形态发生至关重要，然而其在自然沿岸环境中的存在情况仍知之甚少。本研究通过结合生物测定、环境分析、微生物组分析、UHPLC–HRMS及细菌
海洋大型藻类的生长与发育依赖于与其相关联的细菌。在石莼属（Ulva）物种中，诸如thallusin等细菌形态发生素对于正常的形态发生至关重要，然而其在自然沿岸环境中的存在情况仍知之甚少。本研究通过结合生物测定、环境分析、微生物组分析、UHPLC–HRMS及细菌培养实验，研究了德国波罗的海南部基尔峡湾（Kiel Fjord）中thallusin相关形态发生活性的空间与季节变化。研究人员将春季、夏季和秋季采集自32个站点的无菌过滤海水用于测试其诱导无菌石莼（Ulva compressa）配子体正常形态发生的能力。代表thallusin相关活性的形态发生指数（morphogenetic index，MI）呈现出显著的空间和季节差异，夏季活性显著高于秋季。MI与温度呈正相关，与盐度和亚硝酸盐浓度呈负相关。靶向UHPLC–HRMS分析证实了沿岸海水中thallusin的存在，在持续表现出高形态发生活性的站点样品中测得其浓度为0.66 ± 0.21 nmol L-1。探索性微生物组筛查确定了数个候选产生菌属。后续基于培养的生物测定和化学分析证明，四种Algoriphagus属物种能够产生thallusin，且均能在U. compressa中诱导特征性的形态发生表型、细胞壁及假根形成。综上，这些结果为沿岸海水中thallusin的存在提供了首个直接证据，并将已知的thallusin产生菌多样性扩展至Algoriphagus属成员。通过将环境生物测定与化学检测及产生菌的实验验证相结合，本研究为探究细菌形态发生素在大型藻类-微生物互作中的环境动态和生态功能奠定了基础。
论文解读
一、研究背景与科学问题
海洋大型藻类是沿岸生态系统的关键物种，为海洋生物提供栖息地、贡献初级生产力和营养循环。越来越多的证据表明，大型藻类的生长和发育受到共生微生物的强烈影响，由此形成了海藻全生物（seaweed holobiont）的概念。在绿藻石莼属（Ulva）中，正常的形态发生依赖于藻类自身无法合成的细菌性藻类生长与形态发生促进因子（algal growth- and morphogenesis-promoting factors，AGMPFs）。在以Ulva compressa为模式系统的研究中，形态发生受三方互作调控，涉及藻类与两株共生细菌——Roseovarius sp. MS2和Maribacter sp. MS6。前者通过类细胞分裂素活性促进细胞分裂，后者产生形态发生素thallusin，诱导假根和细胞壁的形成。thallusin的EC50值仅为4.9 pmol L-1，是已知活性最强的天然产物之一。
尽管thallusin的生物活性和生物合成已在实验室系统中得到研究，但其在自然海洋环境中的丰度、分布和生态相关性几乎未知。此前研究虽已证明沿岸海水可诱导无菌Ulva配子的正常形态发生，表明水体中存在水传播的形态发生化合物及其细菌产生菌，但thallusin相关活性的空间和季节变化以及贡献于环境thallusin库的微生物类群身份仍 largely 未解。基尔峡湾作为波罗的海南部一个浅水富营养化沿岸系统，具有显著的温度、盐度和微生物群落组成的季节变化，为研究细菌形态发生素的分布和动态提供了理想自然条件。基于此，本研究旨在表征基尔峡湾中thallusin相关形态发生活性的空间和季节变化，并鉴定潜在细菌产生菌。
二、主要技术方法
研究人员采用多步骤综合策略开展研究。2018年5月（春季）、8月（夏季）和11月（秋季），从32个采样站点（19个离岸站点和13个近岸站点）各采集50 mL水样，经0.22 μm无菌过滤后用于生物测定和微生物组分析；2019年春季在站点19和20采集66 L大体积水样用于thallusin的定性和定量分析。主要方法包括：基于无菌U. compressa配子体的形态发生生物测定，通过计算形态发生指数（MI）量化thallusin相关活性；固相萃取（SPE）结合UHPLC–ESI–HRMS进行thallusin的定性与定量检测，采用碘甲烷衍生化方法实现高灵敏度定量；16S rRNA基因V3–V4区扩增子测序进行微生物群落组成分析，通过夏季与秋季的属水平相对丰度比较（火山图分析）筛选候选产生菌；以及基于培养的细菌实验验证，对四种Algoriphagus属模式菌株进行生物测定和化学分析。
三、研究结果
3.1 基尔峡湾中thallusin相关形态发生活性及环境参数
研究人员监测暴露于无菌过滤海水中的U. compressa配子体，以正常细胞壁发育的个体比例作为thallusin样活性的指标。结果显示，不同站点和季节间存在显著的空间和季节差异。夏季MI值范围为0.05至1.00（均值0.37），显著高于秋季（范围0至0.57，均值0.22；配对t检验，n=32，p=0.007），春季居中。MI与温度显著正相关（r=0.348，BH校正p=0.030），与盐度显著负相关（r=?0.364，BH校正p=0.030），与亚硝酸盐浓度显著负相关（r=?0.325，BH校正p=0.035）。站点19和20在春季和夏季持续维持高形态发生活性，被选定用于后续靶向化学分析。
3.2 基尔峡湾海水中thallusin的UHPLC–MS鉴定与定量
对2019年春季采集自站点19和20的海水样品进行SPE富集和UHPLC–ESI–HRMS分析。在单离子监测模式下，两站点样品均在5.10 min处检测到信号，质谱显示质子化分子离子m/z 458.2176，与thallusin的[M+H]+（m/z 458.218）一致，并通过与合成标准品比对确认了thallusin的存在。对站点20的1 L海水样品进行衍生化定量分析，测得thallusin浓度为0.66 ± 0.21 nmol L-1（五次技术重复的均值±SD），该浓度超过U. compressa的EC50值约两个数量级，表明thallusin在自然沿岸水体中以生物学相关浓度存在。
3.3 与形态发生活性相关的微生物群落模式
夏季和秋季样品的微生物组分析共检出52个细菌门，群落以Pseudomonadota为主，其次为Bacteroidota和Cyanobacteriota，三者合计占平均相对丰度的83.6 ± 7.5%。在Bacteroidota门内，Flavobacteriaceae为优势科。作为探索性筛选步骤，研究人员比较了夏季与秋季间属水平相对丰度差异，在570个检出属中，23个属在夏季显著富集（FDR p<0.001）。进一步限定在站点19和20检出的属后，候选分类群缩减至10个。鉴于此前研究已将Bacteroidota成员与thallusin产生相关联，分析聚焦于该门，其中Algoriphagus和Algibacter属被确定为最有希望的候选属。
3.4 Algoriphagus属的形态发生活性与thallusin产生
研究人员选取四种来自不同海洋栖息地的Algoriphagus代表物种进行验证。所有四种菌株均能在无菌U. compressa培养中诱导出与Maribacter sp. MS6相似的表型，即正常的假根和细胞壁形成。对培养上清液进行衍生化UHPLC–HRMS分析，所有Algoriphagus菌株均检出thallusin三甲基酯（m/z 500.2640）。定量分析显示种间thallusin产量差异显著：Algoriphagus chordae产量最高（19.03 nmol L-1），超过阳性对照Maribacter sp. MS6（8.79 nmol L-1）；A. winogradskyi为6.08 nmol L-1，A. machipongonensis为5.42 nmol L-1，A. antarcticus为4.85 nmol L-1。
四、讨论与结论
讨论部分指出，基尔峡湾中thallusin相关形态发生活性的显著季节差异可能反映环境条件对细菌群落组成和代谢活性的调节。MI与温度正相关、与盐度负相关的关系提示，空间和季节变化可能部分反映了环境对细菌群落和代谢的调节作用。然而，现有野外数据无法区分温度和盐度对thallusin产生、稳定性或周转的直接效应与其通过细菌群落介导的间接效应。此外，thallusin除作为形态发生素外，还能与Fe(III)形成复合物并促进Ulva的铁吸收，环境thallusin的可利用性可能受产生、周转、络合和宿主摄取之间平衡的影响。
本研究提供了沿岸海水中thallusin的首次直接检测和定量，证明这一高效形态发生素是沿岸生态系统自然化学景观的组成部分。Algoriphagus属被证明能够产生thallusin，扩展了已知thallusin产生菌的多样性，表明thallusin的生物合成能力在Bacteroidota门内的分布可能比以前认为的更广泛。但研究结果并不证明Algoriphagus属是基尔峡湾中检测到的thallusin的唯一来源，该属成员可能与其他未鉴定的细菌类群共同贡献于环境thallusin库。
研究结论指出，海洋大型藻类依赖于与共生微生物的化学互作，而藻类形态发生素在自然生态系统中的存在和动态此前 largely 未被探索。通过结合形态发生生物测定、微生物组分析和靶向代谢物分析，本研究揭示了基尔峡湾中thallusin相关形态发生活性的显著空间和季节变化。高分辨率质谱证实了沿岸海水中thallusin以生物学相关浓度存在，证明这一高效形态发生素不仅限于实验室系统，也存在于自然海洋环境中。培养实验进一步鉴定出Algoriphagus属的多个成员为thallusin产生菌，能够在U. compressa中诱导特征性的Maribacter sp.样形态发生表型。本研究提供了沿岸海水中thallusin的首次定量测定，并扩展了已知thallusin产生菌的系统发育多样性。研究结果确立了水传播thallusin作为自然存在的海洋生物活性化合物，并凸显了细菌形态发生素作为海藻-微生物群互作介导因子的作用。
