基于膜亲和捕获与质谱联用的复杂毒液混合物肽类配体发现：面向GPCR与配体门控离子通道的受体导向筛选

《Frontiers in Chemistry》：Mass spectrometry-based affinity capture of peptide ligands from complex venom mixtures

　　

动物毒液是靶向膜受体（包括G蛋白偶联受体（GPCRs）和配体门控离子通道）的生物活性肽的丰富来源。然而，由于毒液高度多样且传统筛选方法通量有限，直接从复杂毒液混合物中鉴定受体结合配体在分析上仍具挑战性。在此，研究人员提出一种基于膜的亲和捕获工作流程，并与质谱联用，以回收已知受体配体并优先筛选其他毒液毒素以供验证。该方法将天然膜制备、无标记亲和捕获、基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）以及基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的蛋白质组学鉴定整合于单一分析流程中。其性能通过两个药理学上不同的膜受体家族进行展示：人加压素2型受体（hV₂R），一种G蛋白偶联受体；以及肌肉型烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR），一种配体门控离子通道。该流程回收了涵盖内源性肽和二硫键富集毒液毒素的已知配体，并记录了精氨酸加压素（AVP）依赖性的毒素回收变化。将富含nAChR的Torpedo膜与对照CHO膜所获得的结合组分进行直接比较，进一步鉴定了各膜制备优先保留的毒素。通过将受体导向的亲和选择与直接分子鉴定相结合，该策略为研究配体-受体相互作用以及从高度复杂天然混合物中优先筛选生物活性肽提供了通用分析平台。除毒液研究外，该方法易于适配其他膜受体和分子文库用于配体发现。蛋白质组学数据可通过ProteomeXchange获取，标识符为PXD084762。

研究背景：膜受体是重要药物靶点，其中G蛋白偶联受体（GPCRs，七次跨膜膜受体）约800个成员，占获批药物靶点近35%；配体门控离子通道（LGICs，由配体激活的离子通道）参与神经元信号、肌肉收缩和感觉传递。从复杂生物样品中直接发现受体结合分子仍具分析挑战。动物毒液含超过20万种有毒物种，每种可产生数百种生物活性肽和蛋白质，但仅少部分毒液肽被药理表征。质谱（MS）具无标记、高灵敏和直接分子鉴定优势；已有天然MS、氢氘交换MS、交联MS和亲和选择MS等方法，细胞膜亲和色谱也证明膜受体可在生物相关膜环境中用于配体筛选。毒液组学可高通量表征毒液组成，但主要提供组成信息，通常不直接鉴定与特定分子靶点作用的毒液成分。研究人员前期证明膜基亲和捕获-MS可从毒液组分鉴定肽配体，并发现EIIB，但将该策略用于较大二硫键富集蛇毒毒素及粗毒定量蛋白质组学尚待检验，因此开展本研究。

研究人员将膜基亲和捕获与质谱扩展至较大二硫键富集蛇毒毒素，并考察其在分级和粗毒中的回收；方法整合天然膜制备、无标记亲和捕获、MALDI-TOF MS和LC-MS/MS鸟枪蛋白质组学，以人加压素2型受体（hV₂R）和肌肉型烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）两个药理学不同的膜受体家族评估性能。结论是该流程可选择性回收并分子鉴定从内源性肽到约7.5 kDa二硫键富集毒液毒素的配体，为受体导向配体发现提供通用分析平台，并可适配其他膜受体和分子文库。

关键技术方法概括（不超过250字）：采用天然膜制备：hV₂R过表达的中国仓鼠卵巢（CHO）膜及对照CHO膜购自PerkinElmer；富含nAChR的Torpedo marmorata电器官膜由CEA提供；Dendroaspis angusticeps和Naja kaouthia毒液及组分来自Alphabiotoxine laboratory。核心流程为无标记亲和捕获、MALDI-TOF MS分析及LC-MS/MS鸟枪蛋白质组学鉴定，并用PEAKS X+和MaxQuant/Perseus进行蛋白质鉴定、无标记定量（LFQ）和统计分析。

研究结果：
3.1 针对hV₂R的毒素配体检测与鉴定：研究人员先以精氨酸加压素（AVP）与hV₂R验证，确认该方法可在复杂肽背景中选择性回收已知肽配体；无hV₂R过表达的CHO膜阴性对照中AVP不再于结合组分中检出，支持保留依赖hV₂R而非非特异膜结合。
3.1.1 MQ-1的亲和捕获：将含mambaquaretin-1（MQ-1）的Dendroaspis angusticeps毒液反相HPLC组分D1与hV₂R膜孵育，并以MALDI-TOF MS线形模式比较参考、未结合组分和结合组分。MQ-1在结合组分中明显富集、在未结合组分中信号降低，证明hV₂R膜可从复杂毒液组分中特异捕获约7 kDa二硫键富集毒素；CHO对照膜结合组分未检出MQ-1和H-toxin TA2。H-toxin TA2主要留在未结合组分、结合组分信号较弱；m/z 6951.7信号在两组分间分布较平衡且未能可靠鉴定。直接将粗毒用于MQ-1捕获时未在结合组分检出MQ-1，提示预分级有助于提高捕获和检测效率。
3.1.2 MQ-1与AVP的竞争实验：固定MQ-1组分与hV₂R膜孵育，并加入递增AVP；随着AVP增加，MQ-1在结合组分中的信号下降、在未结合组分中上升；H-toxin TA2结合组分信号较低并也随AVP增加而下降。研究人员强调这些归一化MALDI信号描述信号分配而非结合分子比例，不能据此确定结合亲和力或结合位点；与Ciolek等利用³H-AVP放射性配体置换得到的Ki=2.81 nM不可直接比较，因为本研究使用未纯化毒液组分、MQ-1浓度未知且存在共洗脱成分，实验仅为探索性概念验证且无独立重复和有限浓度点，故只作AVP依赖性信号再分布的定性说明。
3.2 针对nAChR的毒素配体检测与鉴定：先以α-conotoxin GI验证nAChR膜可选择性回收已知配体。
3.2.1 从Naja kaouthia毒液组分亲和捕获神经毒素：将Naja kaouthia毒液经反相HPLC分为62个组分，选取强峰组分及覆盖α-cobratoxin洗脱窗口的组分进行亲和捕获；对未结合和结合组分进行MALDI-TOF信号归一化，并对结合组分做鸟枪蛋白质组学鉴定。α-cobratoxin、cobrotoxin等已知肌肉型nAChR配体在结合组分中占优；tryptophan-containing weak neurotoxin、cobrotoxin-c等呈部分分布但总体偏向结合组分；cytotoxin 4、N. sumatrana cytotoxin 1等无已知肌肉型nAChR亲和性的膜活性毒素也显著富集，提示非特异膜结合可贡献保留；muscarinic toxin-like protein 1主要留在未结合组分，与其报道的低肌肉型nAChR亲和性一致。结果呈现未结合组分独占、未结合组分占优、结合组分占优及单一组分中结合组分占优等分布模式。
3.3 Naja kaouthia粗毒：将粗毒直接与nAChR膜孵育，MALDI-TOF显示部分信号在结合组分富集、部分在未结合组分保留。进一步用LFQ蛋白质组学比较Torpedo结合组分与粗毒、CHO结合组分与粗毒以及Torpedo结合组分与CHO结合组分：α-cobratoxin在Torpedo结合组分中较粗毒更丰富但未达置换FDR阈值；cytotoxin 4和cytotoxin 2在两种膜中均相对粗毒富集；P0CH80等在CHO结合组分中富集；直接比较显示α-cobratoxin、nakoroxin和N. sumatrana cytotoxin 1在Torpedo结合组分中更丰富，而tryptophan-containing weak neurotoxin、cytotoxin 1（P60305）和P01446;P24779蛋白组在CHO结合组分中更丰富；cytotoxin 4在两种结合组分间无显著差异。P14613;P60771蛋白组在三个Torpedo结合组分和三个粗毒样品中定量，在CHO结合组分中均未定量，其统计分类依赖插补。由于CHO和Torpedo膜并非匹配背景，这些比较支持候选优先排序，但不能建立nAChR依赖性结合。

讨论部分总结：AVP在复杂肽背景下仍被hV₂R膜选择性保留，且CHO阴性对照不支持非特异结合；MQ-1捕获表明流程不限于小内源肽，也可处理较大、高度结构化的二硫键富集毒液配体。AVP依赖性MQ-1信号再分布与竞争一致，但不能区分结合位点重叠、空间干扰或负别构；Fouillen等冷冻电镜结构支持MQ-1K39A变体位于V₂R正位口袋，而本亲和捕获实验未确定结合姿势。H-toxin TA2需纯化毒素和受体特异结合实验进一步验证。粗毒中MQ-1未检出说明分级可降低样品复杂性、减少离子抑制并提高低丰度成分检测，但粗毒未检出不能证明无受体相互作用。nAChR体系中α-cobratoxin富集构成稳健验证；弱神经毒素富集可能受丰度和竞争影响；膜活性细胞毒素富集提示非特异膜结合；nakoroxin在粗毒比较中显示Torpedo偏好，但原文未确定其分子基础。分级与粗毒实验互补：分级有利于发现候选，粗毒有助于考察完整混合物中的回收及不同膜制备的保留差异。方法优点包括跨GPCR和配体门控离子通道的通用性、近天然膜环境、无标记MS与定量蛋白质组学整合及快速优先候选；局限包括膜背景非特异、高丰度毒素压制低丰度信号、弱或瞬态相互作用可能在洗涤和离心中丢失，且方法检测保留分子而非药理活性，下游功能实验仍必要。未来可适配其他可建立过表达系统的膜受体、内源肽、抗体、合成肽库和天然产物研究，并可能结合人工智能与结构生物信息学进行候选优先排序。

研究结论翻译：总体而言，本研究证明基于亲和捕获的质谱工作流程可回收并鉴定被含受体膜制备保留的毒液毒素，具有可行性和通用性。通过将膜基亲和富集与MALDI-TOF MS及蛋白质组学分析结合，该方法能在相对简单快速的实验流程中检测从分离肽到粗毒混合物来源的受体相关配体。AVP和MQ-1在hV₂R过表达膜上的成功富集验证了该方法捕获具有不同分子量和结构性质配体用于GPCR靶点的能力。将其应用于Torpedo nAChR进一步证明流程对结构不同受体系统的适应性。膜空白有助于识别实验流程来源信号，而与CHO膜比较揭示无nAChR富集的另一制备也可保留毒素。由于CHO和Torpedo膜并非匹配背景，这些对照支持候选优先排序，但不能为新观察到的毒素关联建立nAChR依赖性结合。