《Frontiers in Microbiology》：Long-read sequencing of clinical multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis reveals a novel ethA structural variant conferring ethionamide resistance
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耐多药结核分枝杆菌（MDR-MTB）是全球结核病控制的重大障碍。尽管全基因组测序（WGS）推进了耐药相关突变的检测，但由于短读长测序技术在解析重复基因组区域和大片段插入或缺失方面的固有局限，结构变异（SVs）的贡献仍未得到充分表征。研究人员应用Oxford N
耐多药结核分枝杆菌（MDR-MTB）是全球结核病控制的重大障碍。尽管全基因组测序（WGS）推进了耐药相关突变的检测，但由于短读长测序技术在解析重复基因组区域和大片段插入或缺失方面的固有局限，结构变异（SVs）的贡献仍未得到充分表征。研究人员应用Oxford Nanopore长读长测序（ONT）对临床MDR-MTB分离株和敏感对照进行测序，并以Illumina短读长测序作为补充。使用BCFtools鉴定变异，并用SVIM-asm独立验证。候选耐药突变比对至2023年世界卫生组织（WHO）突变目录。通过耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）异源表达、最小抑菌浓度（MIC）测定、蛋白免疫印迹（Western blotting）和基于AlphaFold 3的结构建模对已鉴定的SVs进行功能验证。研究人员在WHO目录耐药基因内鉴定出两个未分类SVs：Rv0678中的IS6110插入（c.59_60ins1358bp，p.Gln22fs）和ethA中的131-bp缺失（c.135_265del，p.Trp45fs）。虽然IS6110介导的Rv0678破坏先前已被认为与贝达喹啉（bedaquiline）耐药相关，但ethA缺失代表一种此前未描述的结构变异。在耻垢分枝杆菌中异源表达ethA缺失使乙硫异烟胺（ethionamide）的最小抑菌浓度提高至16倍（256 μg/mL vs. 野生型16 μg/mL），AlphaFold 3结构预测为丧失单加氧酶活性所必需的C端结构域提供了结构学依据。本研究鉴定出一个导致乙硫异烟胺耐药的新型ethA结构变异，并对一个特定Rv0678 IS6110插入等位基因进行了功能验证，证明长读长测序在揭示MDR-MTB中已知和新型耐药机制方面的能力。
结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）是结核病的病原体，耐多药结核分枝杆菌（MDR-MTB；对利福平和异烟肼耐药）持续威胁全球结核病控制。短读长全基因组测序（WGS）虽可检测耐药相关单核苷酸变异和小插入缺失，但难以准确解析重复基因组区域、大插入缺失和移动遗传元件插入，导致结构变异（SVs；≥50 bp的插入、缺失、重复、倒位或易位）检测不足，且新发现SVs的功能验证仍是关键缺口。长读长测序为解析此类遗传结构提供了新手段。Canalda-Baltrons等曾基于859株MTB长读长组装构建泛基因组参考图并发现大量SVs与耐药关联，但关联研究不能单独确立因果关系。为此，研究人员对临床MDR-MTB分离株进行长读长和短读长比较基因组分析，聚焦世界卫生组织（WHO）目录耐药基因内两个未分类SVs，并通过多种实验进行功能验证，旨在建立基因型—表型联系并揭示耐药机制。该研究鉴定出新型ethA结构变异并验证特定Rv0678 IS6110插入等位基因，说明长读长测序可发现已知和新型耐药机制，对耐药诊断和治疗方案选择具有重要意义。
关键技术方法（不超过250字）：研究纳入2023年7月至2024年6月温州中心医院不同患者诊断的11株临床MTB分离株（3株敏感、8株MDR，均来自中国浙江省温州地区）及H37Rv参考株。采用Oxford Nanopore长读长和Illumina短读长WGS，进行去新生组装及杂交抛光；以BCFtools和SVIM-asm鉴定SVs，snpEff注释并比对WHO 2023突变目录；用Sanger测序和表型药物敏感性试验（pDST）验证；在耻垢分枝杆菌（M. smegmatis；快速生长分枝杆菌，用作异源表达宿主）中过表达野生型或SV型Rv0678、ethA，结合RT-qPCR、蛋白免疫印迹、生长曲线、最小抑菌浓度（MIC；抑制可见生长的最低药物浓度）测定及AlphaFold 3结构预测。
研究结果：
Resistance profiles of clinical MTB isolates and the H37Rv strain：通过pDST检测9种抗结核药物，确认8株MDR分离株均至少对利福平和异烟肼耐药；R2–R6和R8还对左氧氟沙星和莫西沙星耐药，符合pre-XDR-TB定义；补充pDST显示吡嗪酰胺和乙硫异烟胺耐药表型与相应耐药基因突变一致。
Long-read sequencing generated near-complete and highly contiguous MTB genomes：ONT和Illumina测序深度均>100×；ONT-only组装平均覆盖H37Rv参考基因组的99.14%，平均仅2.17个contig，连续性优于Illumina-only组装（平均132.5个contig）；Illumina短读长抛光未显著提高基因组覆盖度，错配和插入缺失/100 kbp与杂交组装相当；R10.4.1测序化学提供足够碱基精度用于可靠变异检测，包括SVs。
Identification of MDR-associated mutations and exclusive focus on unclassified SVs within WHO-catalogued resistance genes：BCFtools在MDR特有变异中鉴定3233个突变（含132个SVs：83个插入、49个缺失），涉及588个基因；聚焦65个WHO目录耐药基因后，MDR特有88个突变分布于14个基因，其中65个已分类、23个未分类；仅两个SVs位于WHO目录基因：Rv0678 c.59_60ins1358bp（p.Gln22fs）和ethA c.135_265del（p.Trp45fs）；杂交组装结果几乎一致；SVIM-asm独立鉴定101个MDR特异SVs，其中90个与BCFtools重叠，两个调用器共同检出且位于WHO目录基因内的仅上述两个SVs；核心SNP系统发育显示多数临床分离株属于Lineage 2（L2；谱系2）。
Sanger sequencing and pDST validated the two unclassified SVs：选取6个代表性突变进行Sanger测序，包括3个已分类和3个未分类变异，均获确认；已分类变异的pDST与基因型预测一致；补充pDST显示pncA c.417_424dupGCGCCAGA对应吡嗪酰胺耐药，Rv0678 c.59_60ins1358bp对应贝达喹啉（BDQ）耐药，ethA c.135_265del对应乙硫异烟胺（ETO）耐药，建立基因型—表型联系。
Heterologous expression in Mycobacterium smegmatis confirmed that the two SVs confer drug resistance：RT-qPCR确认Rv0678和ethA在异源表达株中过表达；蛋白免疫印迹检测到野生型全长蛋白，而SV型预测截短肽未检出，原文指出可能与快速降解、未翻译或凝胶系统未能保留肽段有关；各菌株36 h达平台期且密度相当；MIC测定显示Ms_Rv0678_SV的BDQ MIC为4 μg/mL，对照<0.016 μg/mL；Ms_ethA_SV的ETO MIC为256 μg/mL，为Ms_ethA_WT（16 μg/mL）的16倍、Ms_vec（32 μg/mL）的8倍，证明两SVs分别导致BDQ和ETO耐药。
AlphaFold 3-based structural predictions provided structural context for loss-of-function mutations：AlphaFold 3预测显示Rv0678插入导致第22位提前终止，缺失C端44个氨基酸的推定DNA结合阻遏结构域；其机制为IS6110破坏功能性Rv0678阻遏蛋白，使MmpS5-MmpL5外排泵组成性上调、胞内BDQ积累减少；ethA缺失导致移码和提前终止，截短EthA缺失C端结构域；EthA为激活前药ETO的单加氧酶，功能丧失使ETO-NAD加合物不能形成，不能抑制InhA，从而阻断分枝菌酸生物合成并导致耐药。
讨论部分总结：讨论指出，短读长WGS在重复区域和复杂基因组改变解析方面存在局限，而ONT长读长测序可可靠检出SNPs并准确检测短读长易漏检的SVs；两个SVs仅由长读长测序检出，并经Sanger测序、pDST、异源表达、MIC、蛋白免疫印迹和AlphaFold 3功能验证。与Canalda-Baltrons等的大规模泛基因组关联研究相比，本研究提供了其关联发现所缺乏的功能验证，连接群体水平变异识别与个体水平机制理解。Rv0678中IS6110介导的破坏是已知BDQ耐药机制，但c.59_60ins1358bp位于不同位置，是新的等位变异；功能验证支持其导致C端阻遏结构域缺失和MmpS5-MmpL5上调。ethA c.135_265del为新型SV，位于Canalda-Baltrons等报道的较大c.105_1760del区域内，提示其为更广泛耐药相关缺失类的特定等位形式；16倍ETO MIC增加及RT-qPCR、蛋白免疫印迹结果为耐药作用提供功能证据，AlphaFold 3为单加氧酶活性丧失提供结构依据。Lineage 2在研究队列中占优势，与我国流行病学意义和耐药关联一致；MDR特有88个WHO目录基因突变中65个已分类、23个未分类，且多数MDR特异SVs位于WHO候选基因外，提示MDR-MTB耐药组复杂，需持续维护耐药数据库。局限性包括：M. smegmatis异源系统不能完全重现MTB天然调控和代谢背景，内源同源基因MSMEG_1380和MSMEG_6440可能保留部分功能；SV型相对空载体MIC升高的机制尚未解决；截短蛋白需进一步研究；临床分离株样本量小，该新型ethA SV的流行率和广泛临床意义待确定。
研究结论：本研究鉴定出新型ethA结构变异c.135_265del（p.Trp45fs）是此前未报道的ETO耐药原因，并经异源表达、MIC测定、蛋白免疫印迹和AlphaFold 3验证；该缺失导致的16倍MIC增加及C端单加氧酶结构域预测缺失建立了明确的基因型—表型联系。同时，研究验证了一个特定Rv0678 IS6110插入等位基因，证明长读长测序揭示MDR-MTB已知和新型耐药机制的能力。将长读长测序整合入常规诊断流程将增强耐药相关SVs检测并指导更有效的治疗方案。
