颗粒蛋白前体单倍剂量不足通过破坏组织蛋白酶D功能导致小鼠脑内溶酶体异常及TDP-43水平升高

《Frontiers in Molecular Neuroscience》：Progranulin haploinsufficiency disrupts cathepsin D function, resulting in lysosomal abnormalities and elevated TDP-43 levels in the mouse brain

　　

引言： 额颞叶痴呆（FTD）是早发性神经退行性疾病的主要原因之一，常与编码颗粒蛋白前体（PGRN）的GRN基因突变相关。已知PGRN在溶酶体功能中发挥关键作用，其缺失可导致FTD发病。研究人员在此探讨了PGRN缺失对溶酶体稳态的影响，重点关注溶酶体蛋白酶组织蛋白酶D（CTSD）以及TAR DNA结合蛋白43（TDP-43）的聚集，这些是FTD及相关神经退行性疾病的标志性病理特征。 方法： 研究人员利用纯合及杂合GRN缺失小鼠模型，以及GRN与CTSD双基因敲除小鼠，评估了溶酶体功能、CTSD表达与活性、溶酶体相关膜蛋白（LAMP）水平及定位、TDP-43聚集情况以及小鼠生存期。 结果： PGRN缺乏导致溶酶体功能显著改变。尽管PGRN缺陷小鼠中成熟型和未成熟型CTSD水平均显著升高，但其酶活性却显著降低。PGRN缺乏还引起溶酶体相关膜蛋白（LAMP）的积累以及LAMP1阳性溶酶体在核周区域的聚集，提示溶酶体运输受损。相应地，不溶性TDP-43水平显著升高，表明溶酶体功能障碍与蛋白质降解缺陷及聚集有关。值得注意的是，同时缺失PGRN和CTSD的双基因敲除小鼠寿命显著缩短，凸显了这两种蛋白在维持神经元健康和长寿方面潜在的功能性相互作用。 讨论： 这些发现强调了PGRN作为溶酶体功能和蛋白质稳态核心调节因子的重要性。综上所述，这些数据为PGRN依赖性溶酶体生物学提供了机制性见解，并确定了可能促成GRN相关FTD及其他神经退行性疾病的通路。

论文解读

一、研究背景与目的

额颞叶痴呆（FTD）是65岁以下人群中第二常见的早发性痴呆，以额叶和颞叶前部进行性退化为特征，导致行为和/或语言障碍。约40%的FTD病例具有家族遗传性，其中MAPT、GRN和C9orf72基因突变约占家族性病例的80%。GRN基因编码的颗粒蛋白前体（PGRN）是一种进化上保守的多功能富含半胱氨酸的糖蛋白，参与细胞分裂、炎症、肿瘤生长、伤口愈合、溶酶体稳态、神经发育及神经退行性变等多种生物学过程。GRN基因杂合功能缺失突变导致的单倍剂量不足，几乎不可避免地引发伴有泛素化TDP-43阳性包涵体的FTD，患者血浆和脑脊液中PGRN水平约降低50%。然而，PGRN水平降低驱动神经退行性变的机制仍不清楚。越来越多的证据表明，PGRN对溶酶体稳态至关重要，而非仅仅作为降解底物。PGRN缺乏与组织蛋白酶D（CTSD）——一种降解长寿命错误折叠蛋白并调节酶和生长因子活性的溶酶体天冬氨酸蛋白酶——的功能改变相关。此外，几乎所有GRN突变相关FTD患者均表现出TDP-43蛋白病，提示PGRN缺乏与TDP-43蛋白稳态紊乱之间存在密切联系。基于此，研究人员利用多种基因修饰小鼠模型，系统探究了PGRN缺乏与溶酶体功能障碍及TDP-43聚集之间的关系，旨在阐明GRN相关FTD的潜在分子机制。

二、主要技术方法

研究人员构建了多种基因型小鼠模型，包括野生型（WT，PGRN^ntg–CTSD^ntg）、杂合CTSD单基因敲除（PGRN^ntg–CTSD^+/?）、纯合PGRN单基因敲除（PGRN^?/?–CTSD^ntg）、纯合PGRN与杂合CTSD双基因敲除（PGRN^?/?–CTSD^+/?）、杂合PGRN单基因敲除（PGRN^+/?–CTSD^ntg）以及杂合PGRN与杂合CTSD双基因敲除（PGRN^+/?–CTSD^+/?）。所有实验均使用18月龄、雌雄各半的小鼠。主要技术方法包括：①Western blot分析检测CTSD、LAMP1/LAMP2、TDP-43等蛋白表达水平；②体外酶活性检测试剂盒测定CTSD酶活性；③ELISA定量检测脑组织中PGRN蛋白水平；④免疫荧光染色观察LAMP1阳性溶酶体分布及TDP-43亚细胞定位；⑤DAB显色免疫组化检测磷酸化TDP-43（pTDP-43）包涵体；⑥Kaplan–Meier生存分析评估不同基因型小鼠寿命；⑦转棒实验和后肢抓握评分评估运动功能。

三、研究结果

1. PGRN缺乏导致CTSD表达增加但酶活性降低

Western blot分析显示，与WT对照相比，纯合PGRN敲除小鼠（PGRN^?/?–CTSD^ntg和PGRN^?/?–CTSD^+/?）脑组织中成熟型CTSD（mCTSD）和未成熟型CTSD（proCTSD）水平均显著升高。双因素方差分析显示PGRN基因型和CTSD基因型对mCTSD和proCTSD水平均有显著主效应，但两者间无显著交互作用。成熟型与未成熟型CTSD的比值在各基因型间无显著差异，表明CTSD加工过程未发生明显紊乱。然而，体外酶活性检测却显示，尽管CTSD蛋白水平升高，纯合PGRN敲除小鼠的CTSD酶活性却显著降低。将酶活性标准化至mCTSD水平后，PGRN基因型的主效应依然显著，提示PGRN缺乏导致CTSD酶活性与其蛋白丰度之间出现功能性解偶联。值得注意的是，杂合CTSD单基因敲除小鼠（PGRN^ntg–CTSD^+/?）在标准化至mCTSD后，相对CTSD活性反而显著升高。

2. PGRN缺乏增加LAMP1/2表达并诱导LAMP1阳性溶酶体核周聚集

Western blot分析显示，纯合PGRN敲除小鼠（PGRN^?/?–CTSD^ntg和PGRN^?/?–CTSD^+/?）以及杂合CTSD单基因敲除小鼠（PGRN^ntg–CTSD^+/?）脑组织中LAMP1和LAMP2蛋白水平均显著高于WT对照，提示溶酶体生物合成增强或周转受损。然而，LAMP2/LAMP1比值在各组间无显著差异，表明溶酶体膜蛋白的相对平衡未受明显影响。免疫荧光显微镜观察进一步显示，纯合PGRN缺陷小鼠中LAMP1阳性溶酶体不仅数量和体积增加，还出现显著的核周聚集现象，提示溶酶体运输、定位或融合动力学存在缺陷。由于核周聚集程度严重，无法进行可靠的图像定量分析，该数据仅作为溶酶体稳态和空间组织改变的定性证据。

3. PGRN缺乏改变TDP-43溶解度

生化分级分离和Western blot分析显示，各基因型小鼠脑组织中总TDP-43和可溶性TDP-43水平无显著差异。然而，不溶性TDP-43水平受PGRN基因型显著影响。事后多重比较分析显示，纯合PGRN敲除小鼠（PGRN^?/?–CTSD^ntg和PGRN^?/?–CTSD^+/?）以及杂合PGRN敲除小鼠（PGRN^+/?–CTSD^ntg）的不溶性TDP-43水平均显著高于WT对照。免疫荧光分析未观察到TDP-43表达或亚细胞定位的明显差异。此外，对终末期小鼠脑切片进行pTDP-43免疫组化染色，在颞叶皮层区域未检测到神经元或胶质细胞中的胞质TDP-43聚集。这些结果表明，PGRN缺乏促进TDP-43向去垢剂不溶性组分转移，但尚未形成典型的TDP-43蛋白病病理特征，应视为早期生化改变。

4. 纯合PGRN与杂合CTSD双基因敲除小鼠寿命缩短

Kaplan–Meier生存分析显示，六种基因型小鼠的生存率存在显著差异。纯合PGRN与杂合CTSD双基因敲除小鼠（PGRN^?/?–CTSD^+/?）中位生存期仅为639天，显著短于其他所有基因型。相比之下，WT（中位生存期895天）、PGRN^?/?–CTSD^ntg（793天）和PGRN^ntg–CTSD^+/?（950天）小鼠的寿命正常或仅轻度缩短，表明单独的PGRN缺乏或部分CTSD缺失均不足以产生这一显著的生存表型。行为学评估方面，12月龄和18月龄的转棒测试未显示基因型间显著差异；但18月龄时，PGRN^?/?–CTSD^+/?小鼠的后肢抓握评分显著差于PGRN^ntg–CTSD^+/?和PGRN^?/?–CTSD^ntg小鼠，提示联合敲除条件下出现迟发性神经功能缺陷。

5. 杂合CTSD缺失增加PGRN水平并调节CTSD活性

ELISA检测结果显示，所有PGRN缺陷条件下PGRN蛋白水平均显著降低，纯合PGRN敲除小鼠中PGRN几乎无法检测。在仅分析PGRN表达小鼠的数据中，杂合PGRN敲除显著降低PGRN水平，而杂合CTSD单基因敲除小鼠（PGRN^ntg–CTSD^+/?）的PGRN水平反而显著升高。双因素方差分析显示PGRN基因型、CTSD基因型及其交互作用均对PGRN蛋白水平有显著影响。性别分层分析未发现影响结果解读的主要性别差异。这些结果提示PGRN与CTSD之间存在功能性相互作用和潜在的反馈调节机制。

四、讨论与结论

本研究表明，PGRN缺乏导致CTSD表达升高但酶活性降低、LAMP1/2积累和溶酶体核周聚集、不溶性TDP-43水平升高，以及特定基因型组合下寿命缩短和运动功能受损。这些发现支持PGRN作为溶酶体功能和蛋白质稳态核心调节因子的观点。研究人员提出，CTSD可能是GRN相关疾病的遗传或功能修饰因子，部分CTSD活性降低在PGRN缺乏背景下可加重疾病相关表型。研究同时指出，由于小鼠模型未表现出典型的TDP-43蛋白病病理特征，不溶性TDP-43的积累应被视为早期生化改变，可能先于可检测的组织病理学聚集。研究结论认为，PGRN在调节CTSD活性、溶酶体稳态和蛋白质质量控制方面发挥重要作用，CTSD被确定为与PGRN缺乏相关的分子和疾病相关表型的调节因子，但CTSD依赖性溶酶体功能障碍与GRN相关FTD痴呆过程之间的因果关系仍需进一步研究证实。未来研究应致力于确定恢复CTSD功能或增强溶酶体蛋白质稳态是否能减轻疾病相关表型，并采用能发展出更稳健TDP-43病理的模型来评估CTSD功能受损是否直接影响TDP-43聚集、磷酸化、错误定位或清除。