片段连接嘌呤衍生物作为(p)ppGpp合成酶抑制剂：设计、合成与构效关系

《Archiv der Pharmazie-Chemistry in Life Sciences》：Fragment-Linked Purine Derivatives as Inhibitors of (p)ppGpp Synthetases: Design, Synthesis, and Structure-Activity Relationships

　　

细菌严紧反应（stringent response）由警报素核苷酸(p)ppGpp介导，在感染持留、应激适应和抗菌药物耐受中发挥核心作用，使(p)ppGpp合成酶成为新型抗菌策略/疗法的有吸引力靶点。本研究报道了靶向RelA/SpoT同源（RSH）酶的片段连接核碱基衍生物的设计、合成和生物学评价。基于对SAS2/RelP中小警报素合成酶（SAS）腺嘌呤和鸟嘌呤结合的结构认识，研究人员开发了一系列嘌呤基化合物以同时占据保守核苷酸结合区域。初始连接桥类似物活性有限，主要由于溶解性差，促使引入含核糖衍生物以改善理化性质。采用基于高效液相色谱（HPLC）的测定进行生化评价，结果显示对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）SAS1的选择性抑制，最有效化合物显示微摩尔活性（IC₅₀=1.8 μM），而对相关SAS酶观察到很少或无抑制。结构-活性关系（SAR）分析强调连接子长度和核碱基定位对酶选择性的重要性。这些发现确立片段连接核碱基骨架作为开发靶向(p)ppGpp生物合成和细菌严紧反应抑制剂的有前景起点。

研究背景方面，抗菌药耐药（AMR）构成全球健康威胁，2019年The Lancet研究显示约1.27 Mio死亡直接归因于AMR，4.95 Mio死亡与细菌AMR相关；有效广谱抗生素减少及1962—2000年抗生素研究创新缺口导致多重耐药菌增加。耐药、持留和耐受是AMR的重要机制，严紧持留表现为休眠或低活性细胞及短暂抗生素耐受。警报素核苷酸(p)ppGpp（guanosine pentaphosphate (pppGpp) and guanosine tetraphosphate (ppGpp)）是严紧反应第二信使和持留细胞形成核心调节者，其合成与降解由RelA/SpoT同源（RSH）型酶介导，包括长RSH型酶和小警报素合成酶（SAS）。relacin抑制(p)ppGpp合成并可破坏生物膜；Tkachenko et al.报道抑制(p)ppGpp合成酶的合成二萜类似物可减少持留细胞形成、清除生物膜并降低细胞存活。因此RSH型酶被视为开发种特异性抗生素的合适蛋白家族。结构研究显示在金黄色葡萄球菌RelP（SAS2）中ATP的腺嘌呤与GDP的鸟嘌呤结合保守口袋，二者距离7.2 ?；腺嘌呤与Arg78、Arg112、Glu174作用，鸟嘌呤与Lys147、Asn149、Tyr151、Ala186、Glu189作用。研究目的是构建片段连接嘌呤衍生物同时占据腺嘌呤和鸟嘌呤结合区，获得靶向RSH的抑制剂。研究人员设计、合成并评价片段连接核碱基衍生物，初始连接桥类似物活性有限，引入核糖后鉴定化合物21选择性抑制SaSAS1介导的ppGpp合成，半数抑制浓度（IC₅₀）=1.8 μM；这为靶向(p)ppGpp生物合成和细菌严紧反应提供起点，并证明片段连接核碱基骨架的可行性。

主要关键技术方法概述（不超过250字）：研究人员通过化学合成制备片段连接嘌呤衍生物（8a–8c、9a–9q、19–24），采用高效液相色谱（HPLC）抑制实验测定其对BsSAS1、SaSAS1、BsSAS2、SaSAS2的抑制；SAS1/SAS2基因按前述方法制备，蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中异源生产并纯化，监测GDP和ATP转化为ppGpp和AMP，初筛后对>50%抑制者测定浓度-反应曲线。计算建模使用Molecular Operating Environment（MOE）v2024.0601，以蛋白质数据库（PDB）ID 6EWZ为受体构建21结合模式，并进行Mogul Geometry Check；比较SaSAS1、SaSAS2、BsSAS1、BsSAS2结合位点，结构来源分别为AlphafoldDB ID AF-W8TMV6-F1-v6、PDB ID 6EWZ、PDB ID 5F2V、PDB ID 6FGK。无人类样本队列，蛋白为异源表达。

研究结果如下。

2.1 化学：研究人员采用片段连接策略，将两个核碱基通过碳连接子相连，初始连接子长度4和5个CH₂，合成8a–8c和9a–9q；因溶解性差引入核糖，得到19–24，其中19/20连接子7/6原子、21/22为6/5原子，23/24连接于核糖5′-位；通过改变连接子长度、核碱基定位和取代模式开展结构-活性关系（SAR）研究。由此获得两类片段连接嘌呤衍生物并改善理化性质设计。

2.2 体外药理学：HPLC抑制实验显示，8a–8c、9a–9q在2 mM对BsSAS1基本无显著抑制（8b约34%、9b约23%），对BsSAS2无，对SaSAS1无，对SaSAS2仅8b、9f、9l分别约24%、32%、39%抑制；19–24在1 mM对BsSAS1仅21约20%抑制，对SaSAS2无，对SaSAS1中19约20%、23约52%、21约76%抑制；21的pIC₅₀=5.74（IC₅₀=1.8 μM）。不同系列筛选条件（2 mM/5 mM ATP与1 mM/1 mM ATP）限制直接比较，抑制机制尚待实验确定。含核糖且连接子较长的化合物实现SaSAS1选择性抑制。

2.3 计算建模：通过序列和结构比较及21在SaSAS2中的模型，作者提出SAS1/SAS2活性差异与结合位点差异有关：SAS2含天冬酰胺（Asn），SAS1对应丝氨酸（Ser）；21的6-氯取代导致失去与Asn149的氢键，而Ser位点空间较小可能更易容纳氯原子，SAS1的G环（G-loop）更无序/灵活，可能解释SAS2无活性。19、21、23均有三个碳原子连接子，短连接子类似物20、22、24效果差，与模型一致。连接子长度和核碱基定位影响选择性，模型支持21保留天然腺嘌呤/鸟嘌呤关键相互作用。

讨论总结：生物数据表明抑制强烈依赖连接子长度、核碱基定位和靶向SAS酶；较长连接子19、21、23对SaSAS1活性较高，对SaSAS2无相关抑制；选择性可由Asn→Ser交换和G-loop柔性差异解释；仍须优化效力、溶解度和更广抗菌相关性。

研究结论翻译：在本研究中，研究人员设计并合成了片段连接嘌呤衍生物作为细菌(p)ppGpp合成酶的潜在抑制剂。初始连接桥核碱基类似物仅显示有限抑制活性，最可能由于不利的理化性质，尤其是溶解性差。核糖部分的引入改善了化合物设计，并导致鉴定出化合物21为最有前景的抑制剂，其选择性抑制SaSAS1介导的ppGpp合成，IC₅₀为1.8 μM。生物学数据表明，抑制强烈依赖连接子长度、核碱基定位和靶向SAS酶。具有较长连接子的化合物，特别是19、21和23，对SaSAS1显示出比其较短类似物更高的活性，而对SaSAS2未观察到相关抑制。计算建模提示，化合物21能够保留天然腺嘌呤和鸟嘌呤底物在结合口袋中的关键相互作用。观察到的对SAS1而非SAS2的选择性，可能由结合位点的结构差异解释，包括Asn-to-Ser交换和SAS1 G-loop更高柔性，这可能更好地容纳化合物21的6-氯取代鸟嘌呤样部分。总体而言，这些发现表明核碱基基序的片段连接是靶向细菌警报素合成酶的可行策略。尽管需要进一步优化以提高效力、溶解性和更广泛的抗菌相关性，化合物21为开发(p)ppGpp生物合成的选择性抑制剂以及进一步探索细菌严紧反应作为抗菌靶点提供了有前景的起点。