KMT2C与KMT2D通过阶段特异性表观遗传调控软骨形成进而调节骨骼发育

《Bone Research》：KMT2C and KMT2D regulate skeletal development through stage-specific epigenetic control of chondrogenesis

摘要

许多与增强子相关染色质修饰因子突变相关的颅面疾病（包括Kabuki综合征，KS）均伴有骨骼异常。KS是一种颅面发育性疾病，其特征为组蛋白H3赖氨酸4（H3K4）甲基转移酶KMT2D的突变。导致KS中KMT2D依赖性骨骼缺陷的细胞起源和分子通路尚未得到充分阐明。研究人员此前已证实，在小鼠颅神经嵴细胞（cNCCs）（一种参与颅面结构形成的多能干细胞）中删除Kmt2d会损害软骨细胞肥大分化。尽管研究人员观察到cNCC内软骨内成骨存在缺陷，但KMT2D在更广泛的骨骼系统中的角色仍不清楚，且其与旁系同源物KMT2C在骨骼发育中的功能冗余性研究不足。研究人员目前发现，软骨细胞谱系内的KMT2D突变会导致出生后生长缺陷。两种甲基转移酶均缺失的软骨细胞会导致骨形成严重缺陷，揭示了KMT2C/D在软骨内成骨中的冗余作用。这些甲基转移酶调控软骨细胞状态转变，因为KMT2C/D缺失会损害肥大分化。当这两种甲基转移酶在干细胞谱系中被删除时，cNCC无法诱导SOX9激活下游的因子。在分子水平上，H3K4me1在骨骼发育所必需的从头软骨细胞增强子处缺失，并伴随H3K27ac沉积减少，表明KMT2C/D依赖性的增强子 priming（预启动）。研究人员指出了KMT2C/D在促进SOX9和RUNX2转录因子下游基因激活中的作用。研究结果定义了一个由染色质水平修饰介导的调控级联反应，以确保软骨细胞谱系的定型，扩展了组蛋白修饰因子的已知功能，并为骨骼发育不良及相关先天性疾病的表观遗传学基础提供了见解。

**KMT2C与KMT2D通过阶段特异性表观遗传调控软骨形成进而调节骨骼发育：论文解读**

**一、研究背景与科学问题**

骨骼发育是一个精密调控的生物学过程，其中软骨内成骨是大多数骨骼（包括四肢长骨和颅底骨）形成的核心机制。该过程始于间充质干细胞凝聚并分化为软骨细胞，随后软骨细胞经历增殖、成熟并最终进入终末肥大分化阶段，为骨形成提供支架。这一系列细胞状态转变受到一系列转录因子和表观遗传修饰的精确调控。SOX9是启动和维持增殖性软骨细胞命运的关键转录因子，而RUNX2则驱动前肥大软骨细胞向肥大软骨细胞转变并启动骨形成。两者时空表达与活性的精确平衡对正常骨骼发育至关重要。

Kabuki综合征（KS）是一种罕见的颅面发育性疾病，以独特的面部特征、骨骼异常及多器官缺陷为主要临床表现。临床统计显示，高达88%的KS患者伴有骨骼异常，其中身材矮小是常见特征。KS的主要致病基因为KMT2D（KS1型）和UTX（KDM6A）（KS2型）。KMT2D及其旁系同源物KMT2C是组蛋白H3赖氨酸4（H3K4）的单甲基转移酶，主要负责在增强子区域沉积H3K4me1修饰，该修饰是增强子活性的重要标志。尽管KMT2D突变是KS的主要病因，但KMT2D依赖性骨骼缺陷的细胞起源和分子机制尚不清楚。此外，KMT2C突变虽不直接导致KS，但与具有颅面和身材矮小特征的Kleefstra综合征2型（KLEFS2）相关，提示KMT2C和KMT2D在骨骼发育中可能具有功能冗余性，但这一假说此前未被系统研究。既往研究对KMT2D在软骨细胞中的作用存在矛盾结论，例如Kmt2d基因捕获杂合小鼠显示生长板增宽、软骨细胞过度分化，而研究人员此前在颅神经嵴细胞（cNCC）特异性敲除Kmt2d的小鼠模型中却发现软骨细胞肥大分化受阻。这些差异提示KMT2C/D的功能可能具有细胞类型和发育阶段的特异性。因此，系统阐明KMT2C和KMT2D在成骨发育中的协同与独立功能、明确其下游分子机制，对于理解KS和KLEFS2的骨骼病理具有重要意义。

**二、研究策略与主要技术方法**

为全面解析KMT2C/D在骨骼发育中的作用，研究人员构建了多种基因工程小鼠模型和体外细胞模型，并结合多组学分析技术开展研究。

**小鼠模型：** 利用Col2a1-Cre转基因小鼠实现软骨细胞特异性基因敲除，利用Sox10-Cre转基因小鼠实现颅神经嵴细胞（cNCC）谱系特异性基因敲除。通过杂交Kmt2c和Kmt2d条件性等位基因，研究人员获得了软骨细胞或cNCC中KMT2C单敲除（CKO）、KMT2D单敲除（DKO）以及KMT2C/D双敲除（CKODKO）小鼠，并以Cre阴性同窝小鼠作为野生型（WT）对照。此外，在体外使用O9-1永生化小鼠cNCC细胞系，通过CRISPR/Cas9技术构建了KMT2D单敲除（SKO）和KMT2C/D双敲除（DKO）克隆系。

**表型分析技术：** 采用微型计算机断层扫描（micro-CT）评估骨微结构，包括骨小梁体积分数（BV/TV）、数量（Tb.N）、厚度（Tb.Th）、分离度（Tb.Sp）及皮质骨厚度。通过组织学染色（苏木精-伊红H&E、番红O/快绿、阿尔辛蓝/茜素红）观察生长板形态、软骨细胞排列及肥大区特征。

**分子机制分析技术：** 运用免疫荧光（IF）和蛋白质印迹（Western blot）检测蛋白表达水平。利用RNA测序（RNA-seq）进行转录组分析；采用基因集富集分析（GSEA）鉴定受影响的信号通路。通过CUT&Tag技术分析组蛋白修饰（H3K4me1、H3K27ac）在全基因组范围的分布；采用CUT&RUN技术检测RUNX2的染色质结合情况。利用空间转录组学（NanoString GeoMx WTA）分析特定细胞区域（静息、增殖、肥大区）的基因表达谱。此外，整合公开的Hi-C数据和H3K27ac CUT&Tag数据，应用Activity-By-Contact（ABC）模型预测增强子-基因调控关系。

**三、主要研究结果**

**1. KMT2C和KMT2D在软骨内成骨中具有部分冗余功能**

* **通过软骨细胞特异性敲除小鼠模型**，研究人员发现CKODKO（KMT2C/D双敲除）小鼠出生比例低于预期，提示部分围产期致死性；其断奶体重显著降低，并伴有咬合不正和运动不稳。长骨长度在DKO和CKODKO小鼠中均显著缩短，且CKODKO小鼠的骨小梁和皮质骨参数均显著恶化，而CKO小鼠表型正常。这表明KMT2C和KMT2D在骨骼发育中功能冗余，且KMT2D起主导作用。

**2. KMT2C/D突变生长板缺乏有序的柱状排列和肥大分化**

* 组织学分析显示，DKO和CKODKO小鼠的胫骨生长板增厚，软骨细胞柱状排列紊乱，肥大软骨细胞数量及密度降低，而增殖期软骨细胞数量增加。CKODKO小鼠的胫骨骨干内出现异位的SOX9阳性软骨细胞团，提示突变软骨细胞无法正常完成终末肥大分化及软骨吸收，导致骨形成受阻。

**3. KMT2C和KMT2D通过软骨细胞肥大调控骨骼发育**

* P0新生小鼠骨骼染色显示DKO和CKODKO小鼠胫骨骨干钙化区长度进行性缩短。E15.5胫骨免疫荧光实验表明，突变软骨细胞虽能进入增殖期并表达RUNX2，但无法下调SOX9蛋白水平，导致肥大分化受阻。P0生长板中，DKO和CKODKO的肥大区厚度减小，但肥大细胞面积增大，且缺乏正常的固缩和空陷窝，表明细胞向终末分化、死亡和吸收的转变存在缺陷。

**4. KMT2C/D促进cNCC和间充质来源软骨细胞的肥大分化**

* 在Col2a1-Cre驱动的cNCC来源的颅底骨（前蝶骨、基蝶骨）及中胚层来源骨（基枕骨）中，CKODKO均表现出显著的骨化缺陷。KMT2C/D缺失导致H3K4me1水平在增殖区和肥大区显著降低。与胫骨观察一致，颅底软骨细胞中SOX9无法正常下调，RUNX2激活但下游靶基因COL10A1缺乏诱导。此外，CKODKO小鼠中梅克尔软骨持续存在，进一步证明终末软骨分化失败。

**5. KMT2C/D在干细胞中的缺失限制了初始软骨细胞特化**

* 利用Sox10-Cre在cNCC祖细胞中敲除KMT2C/D后，CKODKO-S10小鼠前蝶骨骨化完全缺失，基蝶骨缩小。免疫荧光显示，DKO-S10小鼠的软骨细胞虽能表达SOX9和COL2，但缺乏COL10A1；而CKODKO-S10小鼠的SOX9和COL2表达均极低，表明软骨细胞特化过程本身出现缺陷。这提示KMT2C/D在更早期的软骨谱系特化阶段同样不可或缺。

**6. KMT2C/D是体外软骨细胞特化和肥大分化所必需的**

* 体外分化实验证实，WT cNCC微团培养后阿尔辛蓝染色阳性，而DKO细胞系完全无法染色，表明其丧失软骨分化能力。RNA-seq结果显示，DKO细胞的转录组在分化第5天仍停滞在未分化状态。差异表达基因和GSEA分析揭示了骨骼系统发育和骨化相关基因集的显著下调。Sox9在DKO分化早期表达不足，可能导致了特化失败。

**7. KMT2C/D缺失破坏RUNX2和SOX9驱动的骨骼系统发育基因程序**

* 在DKO细胞中，SOX9下游靶基因（如Acan、Col2a1、Col11a1、Col9a1/2）在分化第5天显著下调；RUNX2下游肥大靶基因（如Alpl、Mmp9、Mmp13）在第12天显著下调。空间转录组学进一步证实，CKODKO-S10小鼠肥大软骨细胞中RUNX2靶基因（Col10a1、Mmp13、Mmp9、Ibsp）表达异常，验证了体外发现。

**8. KMT2C/D缺失损害骨骼发育关键调控因子的增强子活性**

* CUT&Tag实验显示，KMT2C/D缺失导致H3K4me1在大量cNCC增强子区域显著丢失。ABC模型鉴定出82个与骨骼发育相关基因连接的1030个候选增强子。在WT细胞分化过程中，这些增强子获得H3K4me1和H3K27ac活化标记；而在DKO细胞中，这些标记均无法建立。SOX9和RUNX2显著富集于KMT2C/D调控的骨骼增强子，且RUNX2的全基因组结合能力在DKO细胞中大幅下降。这表明KMT2C/D可能通过直接或间接方式协助SOX9和RUNX2结合增强子，进而调控基因转录。

**四、讨论与结论**

本研究揭示了KMT2C和KMT2D在骨骼发育中的关键作用：两者在软骨细胞中功能冗余，其缺失导致严重的骨骼缺陷；遗传或药理学干扰上述过程可能参与KS和KLEFS2的骨骼病理。研究在分子层面阐明，KMT2C/D通过调控增强子H3K4me1和H3K27ac修饰，促进SOX9和RUNX2转录因子对靶基因增强子的结合与激活，从而确保软骨细胞特化和肥大分化的正确进行。作者提出的模型显示，在软骨形成早期，KMT2C/D促进SOX9转录活性并维持其靶基因表达；在肥大分化启动期，KMT2C/D介导的SOX9抑制和RUNX2激活对于基因程序的切换至关重要。KMT2C/D缺失导致H3K27ac降低还提示其可能存在不依赖于催化活性的支架功能，例如通过维持UTX复合物稳定性来调节H3K27甲基化状态。本研究扩展了组蛋白修饰因子在骨骼发育中的已知功能，为理解骨骼发育不良及相关先天性疾病的表观遗传学机制提供了新视角，并强调了增强子调控失常作为骨骼畸形潜在驱动因素的重要性。

**研究结论：** 本研究表明，KMT2C和KMT2D通过阶段特异性的表观遗传调控机制，在软骨细胞特化和肥大分化两个关键节点发挥冗余且必需的功能。其通过调控增强子活性及SOX9/RUNX2转录程序，确保骨骼的正常发育。这些发现确立了KMT2C/D介导的增强子调控在骨骼发育中的核心地位，并为KS、KLEFS2及其他骨骼发育不良疾病的分子诊断和潜在治疗策略提供了理论基础。