《Small》：3D Reconstruction of Nanoparticle Distribution in Tumor Spheroids With Volume Electron Microscopy
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对纳米材料（NM）在细胞超微结构内分布进行空间分辨表征，对于理解NM在生物系统中的归趋与活性至关重要。体积电子显微镜（vEM）在应对该挑战方面具有独特优势，但能够同时分割NM与细胞结构且记录完整的定量流程仍较缺乏。研究人员基于含纳米颗粒（NPs）的肿瘤球状体串
对纳米材料（NM）在细胞超微结构内分布进行空间分辨表征，对于理解NM在生物系统中的归趋与活性至关重要。体积电子显微镜（vEM）在应对该挑战方面具有独特优势，但能够同时分割NM与细胞结构且记录完整的定量流程仍较缺乏。研究人员基于含纳米颗粒（NPs）的肿瘤球状体串行块面扫描电子显微镜（SBF-SEM）数据示例，提出了一套端到端分析流程。该流程采用混合分割策略：对细胞和细胞核使用微调的Cellpose-SAM模型，对金纳米颗粒（AuNPs）采用经验贝叶斯方法。微调模型优于预训练基线和Amira中的基准实验，并对不同样本类型的二维电子显微镜（EM）数据集表现出良好泛化能力，提示其有潜力成为电子显微镜的通用分割模型。NPs分布的完整三维重建显示其优先聚集于核周区域，细胞核至NPs距离的中位数为2.57 μm，且不同细胞间NM摄取量跨越数个数量级。此外，利用三维形状描述符和局部曲率指标对分割后的细胞和细胞核进行形态学分析，可定量获取单切片无法获得的特征。综上，这些结果建立了一个可重复、开放的框架，用于vEM数据中NM分布与细胞形态的联合定量分析。
研究背景：纳米材料（NM）具有可调理化性质，是生物医学应用的重要平台，但其临床转化依赖于对细胞摄取、胞内定位和NM归趋的深入理解，并需在细胞超微结构全背景下解析NM分布。电子显微镜（EM）可在纳米尺度观察生物超微结构和金纳米颗粒（AuNPs）等电子致密NM；体积电子显微镜（vEM，可在纳米尺度对细胞超微结构进行三维成像的电子显微镜技术），尤其是串行块面扫描电子显微镜（SBF-SEM）和聚焦离子束SEM，已可同时三维重建细胞结构与NM分布。然而，从大型异质图像堆栈中提取定量信息仍是计算挑战，依赖准确分割，传统人工分割难以扩展。深度学习框架如Cellpose和Cellpose-SAM虽能分割细胞与细胞核，但主要在光学显微镜数据上开发和验证，向EM图像泛化并非易事；同时，领域内仍缺乏同时提供完整记录的数据集、透明分析流程和系统基准的研究。仅少数工作在同一vEM数据中同时分割NM与周围细胞超微结构，多数研究只分割NM或细胞区室，或依赖荧光标记与vEM、冷冻X射线断层扫描等关联策略，限制了将NM空间分布、聚集和细胞间摄取异质性与精确结构背景进行定量关联的能力。三维分割细胞和细胞核还可获得单切片无法获取的形态信息。为此，研究人员利用肿瘤球状体模型，从vEM数据中同时分割细胞、细胞核和AuNPs，定量NPs摄取、胞内分布以及细胞和细胞核的全局与局部形状描述符，并建立可重复、开放的定量框架；该论文发表于《Small》。
主要关键技术方法：研究使用FaDu（HTB-43，ATCC）细胞球状体，按Gerken et al.方案制备并暴露50 nm AuNPs；采集SBF-SEM体积数据，体素为10 nm × 10 nm × 50 nm。预处理采用Noise2Void去噪和基于归一化互相关的强度配准；细胞与细胞核采用微调Cellpose-SAM分割，AuNPs采用非参数经验贝叶斯分割；随后计算三维形状描述符、局部曲率和NPs-细胞核距离。泛化评估使用HT1080-Hf、A549-UCNP、FaDu-Au和MT-Ti-MIL等二维SEM数据集，其中FaDu-Au和MT-Ti-MIL为前期已发表数据，HT1080-Hf基于已发表样本的新成像，A549-UCNP为本研究制备。
研究结果：
3.1 预处理（Preprocessing）：研究人员用Noise2Void对图像去噪，图像残差分布平滑且大致以0为中心，高倍细节显示噪声被有效滤除，细胞结构和NPs特征得以保留；针对SBF-SEM中仍可能存在的图像方向差异和树脂块轻微形变，采用基于强度、最大化相邻图像对归一化互相关的配准，配准后归一化互相关分布更窄且向高值移动，所有图像对均改善，最终体积为100.00 × 100.65 × 35.05 μm，视觉检查未见明显错位。
3.2 细胞、细胞核与纳米颗粒分割（Segmentation of Cells, Nuclei, and Nanoparticles）：研究采用混合策略，对细胞结构微调深度学习模型，对NPs使用非参数经验贝叶斯方法，并训练细胞和细胞核两个独立模型以支持重叠类别分配。
3.2.1 细胞和细胞核分割（Segmentation of Cells and Nuclei）：微调Cellpose-SAM在平均精度（AP，反映实例检测准确性）和聚合雅卡尔指数（AJI，反映体素级实例描绘准确性）上均优于预训练基线；细胞分割的AJI改善显著，细胞核改善存在但不显著；该模型在所有AP阈值下优于Amira基准实验。二维SEM数据泛化评估显示，微调模型对与训练数据相似的HT1080-Hf、FaDu-Au和A549-UCNP总体更准确，尤其在A549-UCNP中减少漏检；在域偏移明显的MT-Ti-MIL上两种模型均表现较差，但微调模型产生更少虚假检测，倾向于弃权而非过度预测；细胞核模型泛化较差，部分数据集核对比度低，人工标注亦困难。
3.2.2 纳米颗粒分割（NP Segmentation）：研究人员将全堆栈经验强度分布分解为背景和前景（纳米颗粒）分布，非参数期望最大化算法收敛，随后按切片计算前景后验概率并以95%置信阈值生成NPs掩膜；高亮区域被正确赋予高概率，细胞器和染色沉淀等中间特征概率较低，背景趋近于零。该方法基于NPs占据图像最亮强度范围的先验，适用于金属基NM，但不适用于脂质体、聚合物等低对比NM。
3.3 分割掩膜分析（Analysis of Segmented Masks）：
3.3.1 纳米颗粒分布（NP Distribution）：结合细胞、细胞核和NPs掩膜可重建其相对位置；细胞外簇占检测NPs总体积的10.9%，胞内簇中位估计NPs数为76 [27–385]，少数巨大簇可达数百万NPs并呈复杂互连三维网络；NPs主要集中于核周，细胞核至NPs距离中位数为2.57 μm [1.17–3.78 μm]，未检测到核内NPs；NPs距离与特征细胞范围呈中度相关，高摄取细胞未显示系统性不同的空间分布；对完全可见细胞估计Au摄取中位数为0.042 ng/cell [0.013–0.085 ng/cell]，跨数个数量级，与电感耦合等离子体发射光谱（ICP-OES）约0.05 ng/cell的报道相近。
3.3.2 细胞形状描述符（Cellular Shape Descriptors）：研究人员用marching cubes生成高分辨率三角网格并计算平均曲率、曲率和形状指数；细胞和细胞核平均曲率多为正，标准差常超过均值；曲率幅度均值与标准差呈中度正相关，细胞与细胞核回归无显著差异；形状指数均值与标准差呈强负相关，细胞和细胞核趋势略有不同，细胞核斜率更陡；完全位于体积内的细胞和细胞核平均等效直径分别为19.4 μm和12.6 μm，球度和长宽比接近1但细胞变异更大；所有对象分形维数低于2，未显示分形复杂性。
结论翻译：该研究针对含NM细胞的vEM数据缺乏透明、可重复定量分析流程的问题，开发了端到端工作流并公开注释数据集；数据集覆盖100 × 100 × 35 μm、10 × 10 × 50 nm
3采集分辨率，包含124个细胞和83个细胞核，可作为基准资源。样品制备和图像预处理（去噪与堆栈配准）产生适用于下游分析的高质量对齐图像。分割采用微调Cellpose-SAM分割细胞和细胞核、经验贝叶斯分割NPs的混合策略；细胞和细胞核分割在AP和AJI上优于预训练基线和Amira的AI辅助分割工具，微调模型对相似二维EM数据泛化良好，但图像特征差异大时性能下降，提示对训练分布的依赖。同时分割三类目标实现了NPs分布和细胞形态的综合定量：NPs主要位于核周，中位距离为2.57 μm [1.17–3.78 μm]，Au质量摄取跨数量级；形态分析显示细胞和细胞核大致呈球形但几何复杂，三维形状描述符和局部曲率指标可定量获取单切片无法获得的特征。未来可将该分析扩展至类器官或组织支架等更复杂三维模型。总体而言，该研究提供了记录完整、可重复的框架，用于vEM数据中NM分布与细胞形态的联合分析，并可广泛用于纳米医学定量研究。
