丁酸通过调控巨噬细胞极化改善乙型肝炎相关慢加急性肝衰竭的机制研究

《iMetaOmics》：Butyrate ameliorates acute-on-chronic liver failure by regulating macrophage polarization

　　

肠道菌群失调及其代谢物紊乱可能通过肠-肝轴（gut-liver axis）驱动乙型肝炎相关慢加急性肝衰竭（hepatitis B virus-related acute-on-chronic liver failure, HBV-ACLF）的进展，但其具体机制和干预靶点仍不清楚。研究人员收集了50例不同疾病阶段的肝病患者的血液和粪便样本，进行了宏基因组学、代谢组学和转录组学测序，以阐明HBV-ACLF的微生态-代谢-免疫特征。研究人员在ACLF小鼠模型和RAW264.7细胞中评估了粪菌移植（fecal microbiota transplantation, FMT）或丁酸补充后肠道菌群组成、短链脂肪酸（short-chain fatty acids, SCFAs）、肠道屏障完整性、肝损伤和免疫细胞功能的变化，并探讨了其具体调控机制。HBV-ACLF与有益肠道微生物的缺失、丁酸减少、肠道屏障减弱以及细菌成分渗漏入血增加相关，这进一步加剧了肝脏炎症。丁酸增强了肠道屏障，减少了脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）渗漏，并抑制了M1巨噬细胞极化，从而进一步改善了ACLF的疾病进展。机制分析显示，丁酸抑制了巨噬细胞内丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）信号通路的磷酸化，从而抑制其向促炎性M1表型极化。这些发现支持了肠道微生物、短链脂肪酸和免疫失调在ACLF中相互关联的链条，并强调了基于丁酸的调控策略作为ACLF潜在治疗手段的价值。

**一、研究背景与科学问题**

慢加急性肝衰竭（acute-on-chronic liver failure, ACLF）是在慢性肝病基础上出现的急性失代偿临床综合征，以系统性炎症和多器官功能衰竭为特征，短期病死率极高。慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）感染是ACLF的主要病因之一，乙型肝炎相关ACLF（HBV-ACLF）在亚太地区尤为高发。目前ACLF的临床管理仍以支持治疗为主，多数患者无法获得肝移植治疗，迫切需要深入阐明其发病机制并开发靶向治疗策略。

肠-肝轴是连接肠道和肝脏的重要双向网络。生理状态下，肠道屏障可限制有害物质易位，肠道有益微生物的代谢产物如短链脂肪酸（short-chain fatty acids, SCFAs）经门静脉输送到肝脏以调节代谢和免疫功能。然而在慢性肝病中，肠道菌群失调、肠屏障通透性增加及细菌易位可促进肝脏炎症和纤维化，推动疾病向失代偿期和ACLF进展。既往研究已观察到ACLF患者肠道菌群多样性下降、潜在病原菌富集和产SCFAs有益菌减少，其中丁酸的耗竭尤为突出。但菌群和丁酸代谢的特定信号如何将肠道损伤与免疫失调联系起来，以及其因果关系尚不完全清楚。基于此，研究人员开展了本研究，旨在揭示HBV-ACLF中微生物源性丁酸、肠道屏障完整性与系统性炎症之间的联系，并评估丁酸干预的治疗潜力。

**二、研究内容与主要结论**

研究人员从443例患者队列中纳入50例不同疾病阶段的HBV感染者，包括慢性乙型肝炎（CHB，17例）、代偿期肝硬化（CC，8例）、失代偿期肝硬化（DC，13例）和ACLF（12例），收集其血液和粪便样本进行宏基因组测序、靶向代谢组学分析和外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）转录组测序。结果发现，ACLF患者呈现显著的肠道微生态失调和丁酸代谢紊乱：粪便中产SCFAs菌属（如真杆菌属*Eubacterium*、梭菌属*Clostridium*、瘤胃球菌属*Ruminococcus*、布劳特氏菌属*Blautia*和 odoribacter 属*Odoribacter*）显著耗竭，机会致病菌（克雷伯菌属*Klebsiella*、埃希菌属*Escherichia*和肠球菌属*Enterococcus*）富集；粪便丁酸水平显著降低，而血浆丁酸水平反常升高，这可能与肠道屏障受损导致的渗漏有关。ACLF患者血浆中肠道通透性标志物d-乳酸（d-lactate, d-LA）和脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）显著升高，肝组织中脂磷壁酸和LPS免疫组化染色证实了明显的细菌易位。转录组分析显示ACLF患者适应性免疫（B细胞和CD8⁺ T细胞）受抑而固有免疫活化，单核细胞和M1巨噬细胞介导的炎症反应增强。

通过将不同阶段患者粪便移植（fecal microbiota transplantation, FMT）至抗生素预处理并经四氯化碳（CCl₄）和肺炎克雷伯菌诱导的ACLF小鼠模型，研究人员验证了ACLF相关菌群失调可加重小鼠的肝脏和全身炎症。FMT_ACLF小鼠表现出更严重的肝损伤、肝纤维化和脾脏充血，肝脏中F4/80和CD86表达明显升高，M1巨噬细胞和中性粒细胞显著扩增，而M2巨噬细胞减少。16S rRNA测序和SCFA检测证实FMT_ACLF小鼠盲肠中丁酸产生菌属（*Odoribacter*和*Clostridium*）缺失，乙酸和丁酸水平显著降低，再现了患者的微生态-代谢-免疫轴表型。相关性分析显示丁酸水平与ALT和肝M1巨噬细胞数量呈负相关，与*Odoribacter*丰度和肝M2巨噬细胞数量呈正相关。

在验证治疗潜力方面，长期丁酸补充可显著降低ACLF小鼠死亡率并减轻肝损伤、纤维化和炎症浸润，而乙酸无此效果。丁酸逆转了ACLF小鼠肝脏和脾脏中性粒细胞及巨噬细胞浸润，促进巨噬细胞从M1（CD86⁺）向M2（CD206⁺）表型转化；在外周血中，丁酸逆转了ACLF诱导的中性粒细胞和M1巨噬细胞激增，恢复CD4⁺ T细胞和M2巨噬细胞数量，并抑制IL-6和TNF-α的分泌。丁酸还修复了肠道屏障，恢复结肠黏蛋白及紧密连接蛋白（ZO-1、Claudin-1、Occludin）的表达，降低血浆d-LA和LPS水平，并在结肠中促进抗炎性M2巨噬细胞比例增加。值得关注的是，短程丁酸治疗未能显著提高生存率，提示丁酸的作用依赖于长期重塑肠-肝轴的慢性过程。

在机制层面，研究人员使用LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞模型进行RNA测序和蛋白质印迹验证，发现丁酸显著抑制LPS诱导的p38、ERK1/2和JNK磷酸化，从而抑制M1极化及IL-6和TNF-α的分泌。过表达p38基因可显著削弱丁酸抑制M1极化和炎症因子分泌的能力。在ACLF小鼠肝组织中同样观察到丁酸处理后p38、ERK1/2和JNK磷酸化水平显著下降。

**三、关键技术与方法**

本研究综合运用了多组学测序（包括宏基因组测序、SCFA靶向代谢组学、PBMCs转录组测序和RNA测序）、粪菌移植动物模型、16S rRNA基因扩增子测序、流式细胞术免疫分型、免疫组织化学、蛋白质印迹和免疫荧光等技术。样本来源于重庆医科大学附属第二医院感染病科，涵盖CHB、CC、DC和ACLF四组患者。

**四、结果分述**

**HBV-ACLF患者粪便中产丁酸菌耗竭**：宏基因组测序显示ACLF患者α多样性显著降低，菌群结构由Bacteroidota-Bacillota主导转变为Bacteroidota-Bacillota-Pseudomonadota共主导的失调状态；LEfSe分析显示产SCFAs菌属显著减少而条件致病菌富集；KEGG功能注释发现丁酸激酶在ACLF患者中显著耗竭，其丰度与肝损伤标志物和外周血单核细胞比例负相关。

**HBV-ACLF患者丁酸代谢紊乱、肠屏障受损与免疫功能改变**：靶向代谢组学证实粪便SCFAs（乙酸、丁酸、丙酸）在ACLF中显著降低，而血浆SCFAs反常升高，伴随d-LA和LPS水平升高；肝组织免疫组化证实细菌易位；PBMCs转录组分析显示适应性免疫受抑而单核细胞/M1巨噬细胞介导的固有免疫活化；ACLF肝组织MPO、CD68和CD86表达上调。

**FMT加重小鼠肝脏和外周炎症**：接受ACLF患者菌群的小鼠肝损伤和纤维化更严重，肝脏中F4/80和CD86表达升高，M1巨噬细胞和中性粒细胞扩增、M2减少，外周血中促炎细胞因子分泌增加，T细胞减少。

**FMT再现患者的微生态和代谢特征**：FMT_ACLF小鼠盲肠缺少*Odoribacter*和*Clostridium*等有益菌属，丁酸激酶功能下调和丁酸水平降低，丁酸与肝损伤、M1巨噬细胞及M2巨噬细胞比例之间存在显著相关性。

**丁酸补充恢复肠屏障并减轻ACLF**：长期丁酸治疗降低小鼠病死率，减轻肝损伤、纤维化和炎症浸润，促进肝巨噬细胞从M1向M2转化，抑制炎症因子分泌，恢复外周血免疫细胞平衡，修复结肠紧密连接蛋白表达并降低血浆LPS和d-LA水平，同时促进有益菌*Odoribacter*重新定植，形成代谢物与微生态之间的正反馈。

**丁酸通过抑制MAPK信号通路抑制巨噬细胞M1极化**：RNA测序和KEGG富集分析显示丁酸显著改变TNF和MAPK信号通路相关基因表达；蛋白质印迹证实丁酸抑制LPS诱导的p38、ERK1/2和JNK磷酸化；p38过表达可逆转丁酸的作用，在ACLF小鼠肝组织中亦获得一致结果。

**五、讨论与总结**

研究讨论部分指出，HBV-ACLF以深度肠道菌群失调、SCFA代谢失衡和免疫紊乱为特征。*Odoribacter*等产丁酸菌属与丁酸水平、肝功能和免疫特征一致相关，可能是丁酸相关微生态转变中参与HBV-ACLF的有益候选菌属。丁酸的作用机制涉及增强肠道屏障功能、限制LPS易位、调节黏膜免疫以及直接抑制肝巨噬细胞的MAPK信号通路。通过粪菌移植实验证实菌群失调和丁酸代谢受损并非惰性伴随现象，而是驱动HBV-ACLF系统性炎症的活跃因素。研究也存在局限，包括人队列样本量较少可能限制了对不同ACLF分期和不同病因菌群及SCFAs动态变化的全面把握，以及慢性病毒感染和抗病毒治疗对免疫背景和宿主-微生物互作可能产生的影响需要未来研究验证。

研究结论：本研究显示HBV相关ACLF与肠道菌群、SCFA代谢和免疫稳态的显著破坏有关。研究数据证明HBV-ACLF中肠道微生态与免疫应答通过丁酸紧密耦联，为ACLF背后的微生态-代谢-免疫轴提供了新的认识。调节肠道菌群或其代谢产物作为治疗ACLF的潜在途径值得进一步研究。