综合化学图谱、转录组学与功能验证揭示三重发酵滤液复合物（TF Complex）通过协调抗氧化、炎症与表皮稳态干预皮肤衰老

《International Journal of Cosmetic Science》：Integrated chemical profiling, transcriptomics and functional validation elucidate the multifunctional benefits of a triple-ferment filtrate complex for skin aging intervention

　　

目的：皮肤衰老由相互关联的衰老标志驱动，包括氧化应激、慢性低度炎症、细胞衰老、表皮功能受损和细胞外基质（ECM）降解。发酵来源化妆品成分作为多功能活性物日益受到关注；然而，其潜在机制常认识不足。该研究旨在系统表征来源于发酵米、绿茶和藻类的三重发酵滤液复合物（TF Complex）的生物学活性及机制。方法：研究人员采用整合方法，在多种体外皮肤模型中结合化学图谱、转录组分析和功能验证。使用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱质谱（UPLC-Q-Orbitrap-MS）表征化学成分。通过RNA测序（RNA-seq）评估经TF Complex处理不同时间点的人角质形成细胞（keratinocytes）的转录组反应。在与人皮肤衰老相关的角质形成细胞、成纤维细胞（fibroblasts）和重建人皮肤模型中评估功能活性。结果：化学图谱显示该复合物为组成复杂的混合物，含多种生物活性成分。转录组分析揭示时间依赖性反应：早期激活抗氧化防御通路，随后诱导表皮分化相关程序。功能研究显示，TF Complex促进伤口闭合并减弱中波紫外线（UVB）诱导的炎症反应。此外，所选代表性成分turanose、caffeine和p-hydroxybenzaldehyde增强抗氧化及角质形成细胞分化相关基因表达，同时下调皮肤细胞中炎症相关基因表达。在H₂O₂诱导的衰老成纤维细胞中，TF Complex降低衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性和p16/γH2AX水平，同时增加SOD2（superoxide dismutase 2）表达。在重建全厚度炎症老化（inflammaging）皮肤模型中，TF Complex恢复表皮厚度和丝聚蛋白（filaggrin）表达，保持真皮-表皮连接（DEJ）完整性和真皮ECM蛋白，并减少基质金属蛋白酶-1（MMP-1）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）和白细胞介素-1α（IL-1α）释放。结论：TF Complex通过协调调控氧化应激反应、炎症和表皮稳态，发挥与皮肤衰老干预相关的多功能活性。这些发现提供较全面的机制框架，支持发酵来源化妆品活性物用于健康皮肤衰老的开发与应用。

研究背景与问题：皮肤是机体最大器官和与外界环境的主要界面，持续承受内源性和外源性应激；内源性皮肤衰老受遗传、激素变化和细胞修复能力下降等时间相关过程影响，外源性皮肤衰老可由UV辐射、蓝光、污染和氧化剂等环境因素加速。皮肤衰老涉及相互关联的衰老标志，其中线粒体功能障碍驱动氧化应激异常产生和慢性低度炎症（inflammaging），二者相互强化并参与ECM降解、屏障功能受损及皱纹和松弛等外观改变。发酵来源植物复合物因可富集和生物转化植物化合物、增强抗氧化和抗炎活性而受到关注。TF Complex由双发酵秋田米、宇治绿茶和冲绳藻类组成，各成分经米曲霉（Aspergillus oryzae）发酵并辅以酶活化技术，已在保湿和抗衰老护肤品中使用十余年；但其精确化学组成和作用机制表征不足，构成科学理解空白。为此，研究人员整合成分图谱、RNA-seq和功能验证，在相关体外人皮肤模型中系统表征其分子特征和功能活性。

研究开展、结论与意义：研究人员围绕TF Complex开展化学成分鉴定、转录组分析和多种皮肤模型功能验证，得出TF Complex通过协调调节氧化应激反应、炎症、细胞衰老、表皮功能和ECM稳态，发挥与皮肤衰老干预相关的多功能活性；这为发酵来源化妆品活性物的开发和应用提供了较全面的机制框架，并将长期商业使用的高性能复配物与其可测量的生物活性和分子通路联系起来，支持健康皮肤衰老维护。

关键技术方法：采用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱质谱（UPLC-Q-Orbitrap-MS）和RNA测序（RNA-seq），分析1% TF Complex处理原代角质形成细胞8 h和24 h的化学与转录组特征；用定量聚合酶链反应（qPCR）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫染色、免疫荧光及苏木精-伊红（H&E）染色验证；使用划痕、UVB（300 mJ/cm²）、H₂O₂诱导成纤维细胞衰老（quercetin为阳性对照）及UVA联合IL-1β和TNF-α刺激的重建全厚度皮肤炎症老化模型。TF Complex由Maruzen Pharmaceuticals提供，含TF Complex产品由Tatcha LLC提供；原代角质形成细胞、成纤维细胞和重建皮肤模型来自Guangdong BioCell Biotechnology。

研究结果：

1. 通过UPLC-Q-Orbitrap-MS快速鉴定TF Complex的化学成分：通过UPLC-Q-Orbitrap-MS鉴定含TF Complex产品中423种化合物，包括碳水化合物和糖苷（55.52%）、氨基酸和肽（12.01%）、有机酸（9.60%）、咪唑并嘧啶类（9.33%）、酚类（2.64%）等，表明其组成复杂。

2. RNA-seq分析强化TF Complex对氧化、炎症和皮肤屏障的作用：RNA-seq前评估显示1%以下TF Complex处理24 h未引起显著细胞活力降低；8 h和24 h分别有1282和818个差异表达基因（DEGs），共享285个且98%方向一致；8 h富集氧化磷酸化、ATP合成和抗氧化过程，24 h富集皮肤发育和角质化，提示早期线粒体/抗氧化反应和后期屏障相关反应。

3. TF Complex促进划痕角质形成细胞中的皮肤更新：在角质形成细胞划痕实验中，6、12、24和48 h记录显示TF Complex处理组伤口闭合率高于未处理组，提示促进皮肤更新。

4. TF Complex抑制UVB诱导的角质形成细胞炎症细胞因子分泌：UVB（300 mJ/cm²）降低细胞活力并刺激TNFα、IL-6和IL-8分泌，TF Complex恢复细胞活力并抑制这些细胞因子。

5. TF Complex代表性化学成分调控人角质形成细胞基因表达水平：turanose、caffeine和p-hydroxybenzaldehyde均促进划痕伤口闭合；qPCR显示在划痕模型中三者降低CXCL8并分别调节TNC、S100A7、FLG2和DSG1等；在UVB暴露模型中，turanose抑制CXCL8和IL1B并增加FLG2，caffeine增加NRF2、FLG2和DSG1并降低IL1B，p-hydroxybenzaldehyde恢复NRF2。

6. TF Complex减轻H₂O₂诱导的氧化应激相关衰老：在连续传代和H₂O₂诱导的成纤维细胞衰老模型中，SA-β-gal阳性细胞、γH2AX和p16增加，胶原I和SOD2降低；TF Complex或quercetin减轻上述变化，TF Complex在调节p16和SOD2上优于quercetin；ELISA显示TF Complex抑制IL-6和MMP-1并促进pro-collagen I。

7. TF Complex通过减轻炎症老化保护皮肤：在UVA联合IL-1β和TNF-α刺激的重建全厚度皮肤炎症老化模型中，表皮活细胞厚度和filaggrin下降，DEJ胶原IV及真皮胶原I、fibrillin 1和fibronectin减少，MMP-1、MMP-9和IL-1α释放增加；TF Complex恢复表皮厚度、filaggrin、ECM蛋白和胶原IV，并抑制MMPs和IL-1α释放。

讨论总结：讨论部分指出TF Complex为发酵米、藻类和绿茶来源的生物活性复合物，含乳酸、氨基酸、抗氧化剂等；鉴定400余种成分，并选取turanose、caffeine和p-hydroxybenzaldehyde作为代表，三者分别主要来自米、茶和藻，且影响不同生物轴；它们不代表TF Complex全部活性，而是说明多组分协同。RNA-seq和功能验证提示TF Complex主要通过快速降低氧化应激限制下游炎症程序，并直接促进表皮分化/屏障相关程序；划痕和UVB模型中三成分呈现互补调控。H₂O₂衰老模型中TF Complex表现抗衰老作用，主要作为senomorphic而非senolytic。3D炎症老化模型中TF Complex通过维持屏障完整性和ECM稳态对抗损伤。局限性为多为体外模型，需体内临床或临床试验后皮肤活检的离体评估；其多靶点复杂组成需空间转录组学和单细胞RNA-seq等进一步解析细胞类型特异性机制。

研究结论翻译：总之，TF Complex作为一种源自米、绿茶和藻类的三重发酵滤液复合物，表现出与皮肤衰老干预相关的多功能活性。通过整合化学图谱、转录组学和功能验证，该研究显示TF Complex通过协调调控氧化应激、炎症、细胞衰老、表皮功能和ECM稳态促进皮肤韧性。这些发现提供了机制证据，支持发酵来源化妆品活性物用于维持皮肤健康和促进健康皮肤衰老。未来采用体内临床评价以及先进空间和单细胞转录组学方法的工作，将有助于进一步阐明TF Complex的细胞类型特异性机制。