《HUMAN MUTATION》：Functional Characterization of an Immortalized Human Muscle Cell Line Carrying the Heterozygous RyR1 p.T4288_A4290dup Associated With Rhabdomyolysis
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兰尼碱受体1（ryanodine receptor 1, RyR1）在骨骼肌中发挥重要作用，其通过从肌浆网（sarcoplasmic reticulum, SR）释放肌肉收缩所必需的钙离子来介导兴奋-收缩耦联。编码RyR1的基因RYR1突变与多种
摘要专业翻译
兰尼碱受体1（ryanodine receptor 1, RyR1）在骨骼肌中发挥重要作用，其通过从肌浆网（sarcoplasmic reticulum, SR）释放肌肉收缩所必需的钙离子来介导兴奋-收缩耦联。编码RyR1的基因RYR1突变与多种神经肌肉表型相关，范围涵盖核心肌病、中央核肌病以及药物遗传性疾病恶性高热（malignant hyperthermia, MH）。患者的肌肉表型主要取决于突变是显性还是隐性，以及突变在基因中的位置。功能获得性RYR1突变通常影响钙通道的生物物理特性，并与伴或不伴肌病的恶性高热易感性（malignant hyperthermia susceptibility, MHS）相关。从功能角度看，这些突变使钙通道过度敏感，从而促进通道开放，允许更多钙离子从肌浆网释放。近年来，运动性横纹肌溶解症（exertional rhabdomyolysis, ERM）在携带功能获得性RYR1变异的运动员群体中被观察到，但迄今为止尚未有功能学研究探讨此类变异如何影响RyR1钙通道。在本报告中，研究人员使用来自一名携带杂合RyR1重复变异p.T4288_A4290dup（位于第91外显子）的运动性横纹肌溶解症患者的永生化肌肉细胞系，证明该变异的存在与肌管形态学改变、肌管成熟增强以及膜去极化和药理激活RyR1后钙释放增加相关。增强的钙释放将导致更有效的肌肉收缩，但同时也会导致SERCA泵的激活增强、ATP消耗增加以及钙依赖性蛋白酶钙蛋白酶3（calpain 3）酶活性的升高。研究人员推测，这些事件可能是携带该RyR1变异的个体发生运动诱导的横纹肌溶解症的潜在（共）原因。
论文解读
一、研究背景与科学问题
横纹肌溶解症（rhabdomyolysis）是一种潜在危及生命的骨骼肌纤维崩解事件，以血清肌酸激酶（creatine kinase, CK）、肌红蛋白、乳酸脱氢酶和电解质急剧升高为特征，若未及时治疗，可导致急性肾损伤、筋膜间隔综合征、弥散性血管内凝血、心脏心律失常，约10%的病例可致死。其诱因包括毒素和药物（如他汀类）、创伤、病毒感染、体力活动、代谢异常以及遗传性肌肉疾病。由于诱因多样，横纹肌溶解症的病理生理机制并不完全清楚，但最终结局均表现为骨骼肌完整性丧失和肌细胞能量供应衰竭。
在遗传因素方面，编码兴奋-收缩耦联（excitation-contraction coupling, ECC）蛋白的基因致病性变异已被报道与运动后成人型横纹肌溶解症相关，包括RYR1的功能获得性致病性变异、编码SERCA1的ATP2A1基因变异（Brody病）以及编码SERCA2的ATP2A2基因变异。过去十年的研究揭示，约30%的运动性横纹肌溶解症（ERM）患者携带RYR1致病性变异，其中许多人是运动员或半职业运动员，对自己的遗传状态并不知情。ERM还与恶性高热易感性（MHS）相关，后者是一种由RYR1功能获得性致病性变异引起的药物遗传性疾病，在超过50%的患者中可检测到此类变异。
然而，ERM的许多方面仍然模糊不清，特别是MHS与ERM之间是否存在关联，以及携带致病性RYR1变异的ERM患者肌肉是否具有特征性改变。本研究旨在通过表征一名携带杂合RyR1 p.T4288_A4290dup变异（RYR1 c.12861_12869dup CACGGCGGC，第91外显子）的ERM患者来源的永生化人类肌肉细胞系的细胞、生化和生理特性，回答这些问题。该变异此前已在多名ERM患者中被报道，通常与其他RyR1变异联合出现。
二、研究设计与技术方法
研究人员从一名经临床确诊的ERM患者（索引病例Pt ERM_01，12岁男性，CK水平>10000 iU/L）的股四头肌活检中分离成肌细胞，通过携带端粒酶（hTERT）cDNA和Cdk4 cDNA的重组逆转录病毒双重转染建立永生化肌母细胞系（细胞系8191，简称ERM），并以两名无神经肌肉疾病的健康对照供体建立的永生化细胞系（3373号或CTRL1，567A或CTRL2）作为对照。此外，研究人员还获得了三名携带相同杂合RyR1 p.T4288_A4290dup变异的ERM患者（Pt ERM_01、Pt ERM_02、Pt ERM_03）及年龄匹配的男性对照的肌肉活检样本用于质谱分析。主要技术方法包括：免疫荧光显微镜结合QuPath软件进行肌管形态学分析和融合指数计算；Fura-2/AM荧光钙成像技术测量细胞内钙动力学；钙蛋白酶活性测定试剂盒评估酶活性；定量PCR（qPCR）检测基因转录水平；Western blotting检测RyR1蛋白含量；液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）结合dia-PASEF模式进行蛋白质组学分析。
三、研究结果
3.1 携带RyR1 p.T4288_A4290dup变异的永生化肌管在形态学上与健康对照不同且更成熟
研究人员通过DAPI和鬼笔环肽染色对肌管进行形态学分析，共分析了CTRL1（125个肌管）、CTRL2（155个肌管）和ERM（183个肌管）的肌管。结果显示，ERM肌管的平均直径比对照肌管薄68.8%（ERM为33.9 μm，CTRL1为47.5 μm，CTRL2为51.1 μm），平均表面积仅为对照的54.0%（ERM为6480 μm2，CTRL1为11254 μm2，CTRL2为12723 μm2）；ERM肌管的核面积为对照的80.4%，每个肌管的平均核数为对照的79.0%。然而，三组之间的融合指数相似（ERM为0.55±0.03，CTRL1为0.52±0.03，CTRL2为0.52±0.03）。ERM肌母细胞的增殖指数显著低于两个对照细胞系（ERM为1.48±0.16，CTRL1为2.13±0.17，CTRL2为2.20±0.25）。在分化标志物方面，晚期成熟标志物肌钙蛋白T（TNNT3）在ERM肌管中的表达水平比两个对照细胞系高出3倍以上，而早期标志物结蛋白（DES）和肌细胞生成素（MYOG）以及中期标志物肌细胞增强因子2C（MEF2C）的表达水平无显著差异。这些结果表明RyR1变异可能影响肌管的成熟特性。
3.2 ERM个体来源肌管的兴奋-收缩耦联增强
研究人员用Fura-2负载肌管，分别用不同浓度的KCl模拟膜去极化或4-氯-m-甲酚（4-cmc）药理激活RyR1。结果显示，ERM肌管在60 mM KCl刺激下的峰值钙释放（ΔF荧光比值0.60±0.03）显著高于CTRL1（0.36±0.03）和CTRL2（0.31±0.03）；在750 μM 4-cmc刺激下，ERM肌管的钙释放（0.66±0.05）也显著高于CTRL1（0.33±0.06）和CTRL2（0.47±0.07）。4-cmc剂量-反应曲线显示ERM肌管对激动剂的敏感性增加，EC50为144.7±55 μM，低于CTRL1（207.9±47.6 μM）和CTRL2（180.0±76.6 μM）。ERM肌管的静息[Ca2+]i（0.84±0.01）也显著高于两个对照（CTRL1为0.63±0.01，CTRL2为0.65±0.01），但细胞内钙库总量在三组之间相似。qPCR分析显示，ERM肌管中RYR1转录本的相对表达水平显著高于对照，而其他ECC相关基因（CACNA1S、STAC3、CASQ1、CASQ2、ATP2A1）的表达水平无显著差异。Western blotting证实ERM肌管中RyR1蛋白含量显著高于CTRL1（2.64±0.32 vs 1.0，p=0.015）。
3.3 ERM肌管在膜去极化后钙蛋白酶活性增加
研究人员比较了CTRL1和ERM肌管在生理温度（37°C）和热应激（42°C）条件下CAPN1和CAPN3转录本的表达水平。结果显示，CAPN1转录水平在两种细胞系之间无显著差异；而ERM肌管中CAPN3的转录水平在37°C时比CTRL1高3倍（3.1±1.2 vs 1.0±0.08），在42°C孵育4小时后进一步升高至8.0±3.1（CTRL1为1.2±0.4）。膜去极化对CAPN3转录水平无显著影响。在酶活性方面，ERM肌管在60 mM KCl诱导膜去极化后30分钟出现总钙蛋白酶活性的短暂升高（从22496.5±2485.2 RFU升至40155.3±9882.9 RFU），90分钟后恢复至静息水平；而CTRL1肌管在去极化前后钙蛋白酶活性无显著变化（14008.3±524.9 vs 12280.3±1709.2 RFU）。
3.4 肌肉活检的蛋白质组学分析
研究人员对三名携带杂合RyR1 p.T4288_A4290dup变异的ERM患者和年龄匹配的男性对照的肌肉活检进行了质谱分析。主成分分析（PCA）显示ERM组和对照组可以清晰分离。虽然单个蛋白质或线粒体内膜（IMM）组分未单独达到显著性阈值，但作为一组蛋白质，它们表现出协调的正向倍数变化偏移。基于log2FC排名的STRING富集分析显示，最显著富集的基因本体（GO）术语（细胞组分和生物学过程）明确指向有氧呼吸的改变和线粒体内膜的重塑。共有33个蛋白质在ERM患者肌肉活检中含量显著降低。在ECC和钙稳态相关蛋白方面，对照组活检的蛋白含量较为均一（约10%变异），而ERM组个体间变异较大（>50%）。肌球蛋白重链亚型分析显示，Pt ERM_01的肌肉活检含较高比例的快肌纤维，Pt ERM_02主要为慢肌纤维，Pt ERM_03主要为快肌纤维，表明ERM组的纤维类型组成比对照组更异质。
四、讨论与结论
本研究首次对与人类横纹肌溶解症相关的RyR1变异（RyR1 p.T4288_A4290dup）的功能特性进行了表征。研究存在一定局限性：仅表征了一条携带该杂合RyR1重复变异的细胞系，且未对索引病例进行全外显子组分析，因此不能完全排除存在其他影响钙稳态的遗传变异的可能性。然而，该变异此前已在MHS表型患者（Levano等）、ERM患者（Dlamini等）以及ERM合并恶性高热患者（Sambuughin等）中被报道，支持该变异是ERM表型的原因。该重复变异位于RyR1残基T4288和A4290之间，此区域被报道为RyR1钙通道开放的负调控区域——Du等研究表明，在dyspedic肌管中表达缺失残基Δ4274-4535的RyR1构建体会增加电刺激诱发的钙瞬变最大幅度并改变电压门控钙释放，提示该区域的插入重复可能干扰钙释放的负调控。
关于钙稳态，携带该变异的肌管与已表征的MHS相关功能获得性变异（如p.R163C和p.V2168M）在生理上不同：ERM肌管在膜去极化和药理激活后钙释放量显著更高，尽管其细胞内钙库总量与对照相似。ERM肌管静息[Ca2+]i的轻度升高可能与RyR1变异相关的钙内流增加或肌管分化程度更高有关。
关于钙蛋白酶，ERM肌管中CAPN3转录水平更高，且在膜去极化后钙蛋白酶酶活性显著增加。肌浆中钙浓度升高可激活钙蛋白酶3的自催化活性，促使其从M带（非活性形式）转位至胞质（活性形式），导致肌动蛋白结合蛋白（如肌节蛋白、踝蛋白）和亲联蛋白（junctophilin）的降解。这些事件与肌膜重塑相关，但若反复发生（如反复离心运动），可能导致肌膜完整性丧失，为横纹肌溶解症提供潜在联系。
蛋白质组学分析显示，ERM患者肌肉活检与对照相比总体蛋白组成差异不大，但两组可清晰区分。与携带隐性Ryr1变异的小鼠肌肉中蛋白质含量的大幅变化相比，人类横纹肌溶解症患者的肌肉活检与对照更为相似。ERM肌管中RyR1含量增加但成熟肌肉中未观察到相同变化，可能因为成熟肌纤维中ECC相关蛋白含量远高于肌管，RyR1蛋白在肌浆网膜上的插入可能已达到饱和水平。
研究结论指出，在正常静息条件下，完全分化的肌肉可以应对RyR1重复变异带来的生理变化，但在应激条件下（如高强度运动和高温环境），这种精细平衡被打破，引发一系列事件最终导致肌纤维死亡和横纹肌溶解症。研究人员假设，功能获得性RyR1 p.T4288_A4290dup变异导致ECC增强和肌浆网释放更多钙离子，促进肌肉收缩和分化，可能还导致肌肉肥大；但这种增加的钙释放会（i）在运动期间更大程度地激活SERCA泵，以及（ii）激活钙依赖性肌肉酶如钙蛋白酶。这些事件的组合可能导致肌肉崩解和横纹肌溶解症，尤其是在高强度运动训练和高温环境条件下。该发现对诊断和预后具有参考意义，因为目前诊断实验室尚未报告该变异。
