四种吡唑衍生物的PEG、壳聚糖及壳聚糖-PEG纳米载体系统理化表征与体外细胞毒性比较研究

《Kuwait Journal of Science》：Physicochemical characterization and in vitro cytotoxicity of pyrazole derivatives formulated with PEG, chitosan, and chitosan-PEG nanocarrier systems

　　

将四种吡唑衍生物分别采用壳聚糖（Chi）、聚乙二醇（PEG）及Chi–PEG系统进行制剂化。各制剂表现出不同的流体力学尺寸和表面电荷特征。热分析显示降解行为呈制剂依赖性变化。制剂化衍生物对MCF-7和HepG2细胞表现出细胞毒性活性。比较性研究结果支持对聚合物基吡唑制剂开展进一步研究。

癌症仍是全球主要死亡原因之一，传统化疗常伴随严重全身毒性、吸收有限及对癌细胞选择性不足，因此需要高效、选择性更好的治疗策略。杂环骨架因结构多样和生物活性广泛而成为药物化学的重要结构类型；其中含氮杂环吡唑存在于多种生物活性分子和已批准治疗药物中，其母核可通过不同取代基调节极性、亲脂性、代谢稳定性和生物活性，并可作用于激酶、凋亡调节因子和细胞周期蛋白等靶点。已有研究显示吡唑类化合物可通过抑制关键信号通路、调节凋亡、抑制肿瘤相关酶和干扰细胞增殖等发挥抗癌作用。然而，吡唑类药物的临床应用的常受非特异性分布、稳定性弱、药代动力学不理想和水溶性差限制。聚合物纳米系统可改善抗癌化合物溶解性、保护活性分子并控制理化性质；壳聚糖为天然阳离子聚合物，可与带负电细胞膜发生静电作用以改善细胞吸收，PEG化可提高纳米粒稳定性、延长循环时间并减少免疫系统调理。现有报道多集中于单一聚合物平台或有限治疗分子，对不同聚合物载体递送结构多样吡唑衍生物的比较评价仍有限，尤其Chi与PEG组成的杂化纳米系统对吡唑类化合物理化特征和生物活性的影响尚不充分。基于此，Laila A. Jaragh-Alhadad等系统比较Chi、PEG及杂化Chi-PEG纳米制剂作为吡唑衍生物递送平台的作用，考察粒径、表面电荷、形貌、热行为及对HepG2和MCF-7细胞的体外细胞毒性，旨在为聚合物制剂的理性选择提供比较框架，而不旨在建立细胞摄取、靶向递送或治疗疗效。上述内容表明该研究的必要性在于在可比实验条件下整合理化表征与细胞毒性评价，明确制剂组成、理化特征与体外细胞毒性反应之间的关系。

关键技术与方法：四种吡唑衍生物由Abdelkhalik等建立的一锅多组分策略合成，并经¹H和¹³C NMR（核磁共振）、FTIR（傅里叶变换红外光谱）和质谱确认。研究以低分子量Chi、PEG（MW 4000–6000）构建Chi、PEG及Chi-PEG（Chi:PEG=1:1）体系，药物与聚合物比例1:5；采用SEM（扫描电子显微镜）观察游离衍生物形貌，DLS（动态光散射）和电泳光散射测定流体力学直径、PDI（多分散指数）及zeta电位，TGA（热重分析）评价热降解行为，MTT法检测游离及制剂对MCF-7、HepG2和HEK-293细胞的体外细胞毒性，处理72 h，n=3生物学重复、每浓度4个技术复孔。HepG2（ATCC? HB-8065?）和MCF-7（ATCC? HTB-22?）细胞系来自Dasman Diabetes Institute-Kuwait，HEK-293作为非癌对照模型。

研究结果：
3.1 制剂前吡唑衍生物形貌：SEM在20 kV及多种放大倍数下观察游离吡唑衍生物。Agent 1主要呈不规则、锐边、海胆样分支结构；Agent 2与Agent 1相似但表面相对平滑；Agent 3呈聚集簇状组装；Agent 4表面粗糙、异质，可见凹陷和不规则结构。该部分仅描述游离化合物表面形貌，不能作为制剂形貌、包封、细胞摄取或定位证据。

3.2 制剂前后粒径分布分析：DLS显示游离PEG、Chi和Chi-PEG对照粒径分别约为147.5±9.75 nm、449.9±103.8 nm和21.1±5.66 nm（97.2%）。制剂后粒径变化依赖吡唑衍生物和聚合物组成；Agent 1仅轻度增大，Agents 2–4增大更明显，尤其Chi-PEG体系。游离衍生物PDI多约为1.0，提示异质分布；Agent 1/Chi的PDI最低为0.30，Agent 4/PEG的PDI降低较明显，但多数制剂仍非均一单分散。该结果说明制剂相关流体力学行为改变，不能直接确认包封效率、载药量或聚合物-药物结合机制。

3.3 表面电荷及其与细胞毒性关联：zeta电位显示游离Agent 1近中性略正（1.84±3.35 mV），Agents 2–4为负（约–4至–9 mV）；PEG制剂后均转为正值（11.5–19.9 mV）；Chi制剂后正值升高，如Agent 1和Agent 2分别为38.7±3.88 mV和21.7±4.48 mV，多数Area%>80%；Chi-PEG制剂保持正值（1.66±3.34至29.2±4.02 mV），空白Chi-PEG最大值为43.6±3.66 mV。正电荷可能有利于与负电细胞膜静电作用，但表面电荷不能证明细胞关联、摄取、内化或靶向递送。

3.4 纳米制剂前后热稳定性：TGA在25–800 °C、氮气、10 °C/min条件下分析。游离Agent 2在约283 °C出现约51%明显失重，Agent 1早期失重有限，Agents 3和4呈中间分解行为。PEG制剂中Agents 1和2起始失重约81–83 °C、总失重约91–92%，Agent 3起始约143 °C、失重约86%，Agent 4起始约83 °C、失重约62%。Chi制剂起始失重约79–84 °C、总失重约93–96%，曲线较接近。Chi-PEG制剂中Agents 1和2起始约80–91 °C、失重约92–96%，Agents 3和4起始分别约182和144 °C、失重约52%和54%。作者将其解释为制剂后热分解行为改变，而非直接证明化学稳定性提高或特定聚合物-药物相互作用。

3.5 体外细胞毒性与选择性：作者指出未在同条件下独立评价空白Chi、PEG和Chi-PEG载体，故不能完全区分载体本身对细胞毒反应的贡献。
3.5.1 游离吡唑衍生物体外细胞毒性：MTT显示游离衍生物对MCF-7的IC₅₀为83.33±2.13至106.2±1.61 μM，Agent 4表观活性最高；对HepG2为83.94±8.75至89.13±1.34 μM，范围较窄；对HEK-293为100.0±1.00至149.9±7.68 μM，普遍高于癌细胞。SI（选择性指数）提示差异细胞毒，但不能解释为癌特异性靶向或选择性摄取。
3.5.2 PEG制剂体外细胞毒性：PEG制剂对MCF-7的IC₅₀为79.95±8.84至90.79±6.22 μM，Agent 4最低；对HepG2为82.15±1.41至85.72±5.31 μM，Agent 3最低；对HEK-293为102.3±1.90至129.9±7.80 μM。SI约1.14–1.53，表明细胞毒活性被保留且呈有限 preferential 差异，不能解释为癌特异性靶向。
3.5.3 吡唑衍生物Chi制剂体外细胞毒性：Chi制剂对MCF-7的IC₅₀为79.36±2.08至88.07±1.19 μM，Agent 4最低；对HepG2为82.07±1.18至83.98±9.46 μM，各制剂较接近；对HEK-293为103.4±2.72至119.0±9.90 μM。结果提示Chi制剂保留对MCF-7和HepG2的细胞毒活性，并对HEK-293呈较低表观毒性；但未直接评价摄取、内化或膜相互作用。
3.5.3（原文重复编号）吡唑衍生物Chi-PEG制剂体外细胞毒性：Chi-PEG制剂对MCF-7的IC₅₀约80.99±9.75至83.95±8.86 μM，对HepG2约74.79±6.23至81.74±5.47 μM，对HEK-293约95.46±3.07至101.2±1.64 μM。SI均>1但仅约1.21–1.45，作者将其解释为有限差异细胞毒，而非强癌选择性或靶向。

讨论部分总结：作者强调，PEG、Chi和Chi-PEG制剂与游离衍生物相比保留了可测的体外细胞毒活性，部分数值上IC₅₀降低，但未进行游离与制剂间直接统计比较时不能解释为显著增强。Chi-PEG虽在部分指标上显示数值上较有利的细胞毒谱，但现有数据不能证明其相对PEG或Chi具有统计学优势。MTT法反映细胞代谢活性变化，不能直接测定细胞摄取、内化、胞内定位或死亡机制；阳性zeta电位仅提示电动表面特征改变，不能证明增强膜相互作用或内化。HEK-293仅代表一种非癌细胞模型，不能据此确立对正常组织的普遍安全性。空白载体未独立评价是重要限制。未来需开展体内验证、细胞摄取与定位、载药与包封效率、释放动力学、生物体液稳定性、凋亡/氧化应激/细胞周期及分子信号机制、更多癌细胞和非癌细胞及3D肿瘤球模型、长期稳定性、批间重现性和剂量优化研究。

研究结论翻译：总之，本研究证明了含四种吡唑衍生物的PEG、Chi和Chi-PEG制剂的比较性理化表征和体外细胞毒性。SEM显示游离吡唑衍生物具有不同形貌；DLS和zeta电位测定显示制剂相关的流体力学粒径、粒径分布和表面电荷差异；TGA进一步表明不同聚合物系统制剂后热分解谱发生变化。制剂化衍生物对MCF-7和HepG2细胞表现出可测的细胞毒活性，而在所研究条件下非癌HEK-293细胞模型通常观察到更高IC₅₀值。总体而言，结果说明吡唑衍生物经PEG、Chi和Chi-PEG制剂化与其理化特征差异相关，同时保留可测的体外细胞毒活性。在可确立这些制剂的治疗优势之前，仍需进一步研究确定包封或结合效率、载药能力、释放行为、制剂形貌和稳定性、细胞摄取与胞内定位、作用机制以及体内疗效和安全性。