治疗性寡核苷酸与偶联物表征中离子对反相液相色谱-质谱的最新进展：从离子对优化到无离子对绿色分析

《Analytical Science Advances》：Recent Advances in Reversed-Phase Liquid Chromatography for Therapeutic Oligonucleotide and Conjugate Characterization: From Ion-Pairing to Green Analytical Approaches

治疗性寡核苷酸（oligonucleotides, ONs）已迅速成为制药工业中的一类新型治疗药物，过去十年已有超过25种药物获批。离子对反相液相色谱-质谱联用（ion-pair reversed-phase liquid chromatography coupled with mass spectrometry, IP-RPLC-MS）是ONs表征的常用方法。本综述批判性审视IP-RPLC-MS用于ONs分析的最新进展，重点讨论三类关键应用中最佳色谱条件的选择：单链ONs的杂质谱分析、新型偶联物（如脂质和肽偶联ONs）的表征，以及非变性条件下双链小干扰RNA（small interfering RNAs, siRNAs）分析。最后，结合制药和生物分析应用，讨论无离子对反相液相色谱（ion-pair-free reversed-phase liquid chromatography, IP-free RPLC）的最新进展。

1 治疗性寡核苷酸及其作用机制
治疗性寡核苷酸（oligonucleotides, ONs）因对RNA具有高序列特异性，可靶向既往难以治疗的遗传性疾病，近年来在制药研发管线中快速扩展。其主要类别包括反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides, ASOs）、小干扰RNA（small interfering RNAs, siRNAs）、微小RNA（microRNAs, miRNAs）、剪接转换寡核苷酸（splice-switching oligonucleotides, SSOs）、适配体、向导RNA（guide RNA, gRNA）和信使RNA（messenger RNA, mRNA）。SSOs通常为18–30个核苷酸的吗啉代单链ONs，在细胞核内结合前体mRNA并空间调控剪接；ASOs为16–21个核苷酸的单链分子，直接结合mRNA；siRNAs为约21个核苷酸的双链分子，引导链进入RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex, RISC）后识别靶标，并通过RNase H1或Argonaute 2介导降解或空间阻断发挥作用；miRNAs约18–25个核苷酸，可模拟或抑制内源性miRNAs；适配体为15–80个核苷酸的单链DNA或RNA，以高亲和力结合靶蛋白；gRNAs约100个核苷酸，用于CRISPR介导的基因编辑；mRNAs约1000至数千个核苷酸，可编码治疗性蛋白。

2 ON结构、化学修饰及密切相关杂质来源
2.1 ASOs和siRNAs的化学修饰
ASOs和siRNAs是临床进展最快的ONs类别。核苷酸由磷酸骨架、核糖和核糖1′位Watson–Crick碱基构成；ONs亲水且骨架带负电，细胞膜通透性有限并易受核酸酶降解，因此常对磷酸骨架、核糖和核碱基进行化学修饰。硫代磷酸（phosphorothioate, PS）骨架是最广泛使用的修饰，可增强核酸酶抗性和血浆蛋白结合，但需优化PS数量与位置以平衡毒性和疗效。siRNAs通常每链仅含少量PS，而部分ASOs为全PS修饰。PS引入磷手性，可产生Rp/Sp非对映异构体，理论上n个PS修饰可形成2ⁿ种立体异构体，并影响药物性能。其他骨架修饰包括磷二硫代（PS₂）、甲基膦酸酯和甲氧丙基膦酸酯等。核糖2′-OH替换可降低免疫刺激，常用2′-O-甲基（2′-OMe）、2′-O-甲氧乙基（2′-MOE）和2′-脱氧-2′-氟（2′-F）等修饰；碱基类似物如假尿苷、2-硫尿苷、N6-甲基腺苷和5-甲基胞苷可降低先天免疫识别并增强核酸酶抗性。多种位点特异性修饰常联合使用，如patisiran同时含2′-OMe和2′-F，胆固醇偶联siRNA可联合2′-OMe与PS修饰。

2.2 ONs合成与结构相近杂质来源
ONs主要经固相合成（solid-phase synthesis, SPS）制备，mRNAs则多通过体外转录酶法生成。SPS包括二甲氧基三苯甲基（dimethoxytrityl, DMTr）脱保护、与下一亚磷酰胺偶联、亚磷酸三酯氧化或硫代，以及最终切割和脱保护等步骤。合成不完全、副反应和降解可产生长度变异体（短链和长链杂质）、PS产物中的磷酸二酯（phosphodiester, PO）杂质、N3-(2-氰乙基)胸腺嘧啶（CNET）、脱氨、脱嘌呤和氧化杂质；配体偶联不完全可导致裸链残留。siRNAs的两条链分别合成后退火形成双链，单链短链杂质可能与互补链杂交形成双链杂质，因此需在单链和双链水平评估纯度并定量残留单链。

3 IP-RPLC保留机制与关键参数
3.1 IP-RPLC机理框架
IP-RPLC保留机制主要有离子对模型和动态离子交换/静电模型。前者认为流动相中离子对试剂（ion-pairing reagent, IPR）与带电ONs形成中性离子对复合物并与反相固定相作用；后者认为疏水IPRs吸附于反相固定相形成带电层，ONs通过静电作用保留。梯度初期IPRs强吸附，ONs保留主要由表面离子作用主导，有机改性剂剥离IPRs后ONs洗脱，疏水作用亦贡献选择性。ONs在IP-RPLC中对有机洗脱液组成高度敏感，线性溶剂强度（linear solvent strength, LSS）模型中S参数可达20–200，远高于小分子的3–5，表现为“结合-洗脱”式保留，方法开发常采用窄流动相强度窗口和浅梯度。

3.2 影响IP-RPLC保留和选择性的参数
3.2.1 ON长度和序列依赖性
ONs保留由ON–IPR复合物疏水性和骨架电荷数共同决定。通常较长ONs保留更强，但长度差异的相对影响随链长增加而减小，短链种类更易与短链杂质分离。核苷酸疏水性贡献大致为U～C ＜ G ＜ A ＜ T，C/G富集序列较早洗脱，A/T富集序列较晚洗脱；DNA通常比RNA更疏水。2′-F、2′-OMe和2′-MOE等修饰增加疏水性和保留，PS修饰亦增加保留并可产生非对映异构体而复杂化分析。

3.2.2 流动相组成的作用
IPRs按烷基链疏水性分为弱、中等和强类型。弱IPRs如三乙胺（triethylamine, TEA）和二异丙胺（diisopropylamine, DIPA）需5%–15%乙腈（acetonitrile, ACN）洗脱ONs；较强IPRs如己胺（hexylamine, HA）或二丁胺（dibutylamine, DBA）需约30%–40% ACN；辛胺（octylamine, OA）等需＞50% ACN。疏水IPRs所需有机改性剂比例高，可降低序列疏水性对选择性的影响。弱/强IPR动态比例、共溶剂/IPR梯度及分段或多线性梯度可提升方法灵活性，但高度依赖样本且转移性有限。IPR浓度过低可致不完全离子对，提高浓度通常增强保留和表观分辨率，但需在同一洗脱窗口比较并调整梯度。烷基胺pKa约10.5–10.7，接近该pH时IPR去质子化而失去功能，推荐流动相pH为7–9.5；高温通常为60°C，可改善扩散和传质、降低峰宽并消除二级结构影响，但也会降低疏水保留和PS非对映体分离。反离子中乙酸和1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇（1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol, HFIP）分别常用于紫外和质谱检测；HFIP可改善分离，不同IPR的最佳HFIP浓度不同。其他氟醇中，HFMIP与疏水IPR联用对PS-ONs和长度分离略优；三氟乙醇和五氟丙醇因pKa较高而不适用，nonafluoro-tert-butyl alcohol可显著抑制MS信号。有机改性剂在C₁₈上通常ACN优于甲醇，洗脱强度大致为甲醇＞乙醇＞ACN＞异丙醇。

3.2.3 色谱柱选择
C₁₈柱是IP-RPLC分析ONs的常用选择；C₄和C₈短链固定相降低疏水作用和IPR吸附，保留较低并改善非对映体分离，但峰较宽且不利于N/N?x杂质分离。PS-ONs杂质谱分析若需抑制PS驱动选择性，C₁₈更优。苯基和氟苯基固定相可提供π–π作用，但在IPR主导的IP-RPLC中选择性差异较小；苯基和氟苯基固定相在制备规模PS-ONs中可改善短链杂质置换和后洗脱杂质分离。烷基-酰胺（SG-AP）和胆固醇（SG-CHOL）等混合固定相可分辨单碱基差异的同长ONs，但其对密切相关杂质的广泛适用性仍待充分研究。

3.2.4 ONs非特异性吸附与残留
ONs易在不锈钢毛细管、柱筛板和LC-MS金属部件上发生非特异性吸附，该吸附为离子性并依赖流动相pH；金属氧化物呈两性，在酸性至中性pH下更带正电。不锈钢柱初始进样可造成显著样品损失，回收率随进样次数增加而提高，但柱清洗可破坏饱和状态；生物惰性柱硬件可在首次进样时接近完全回收，因而被推荐用于IP-RPLC-MS分析ONs，尤其LC-MS定量。

3.3 质谱检测
MS检测中负离子模式通常优选，磷酸二酯骨架易生成[M–nH]^n?离子，但流动相阳离子可造成加合物信号分散；正离子模式亦可分析含氮碱基的ONs。与序列相比，反离子和IPR选择对LC-MS灵敏度影响更显著；HFIP基流动相较乙酸盐缓冲液可提高MS信号1–3个数量级。IPR浓度通常以5–25 mM为宜，因其两亲性会在液滴表面累积并降低ONs解吸效率；烷基胺的沸点、质子亲和力、分配系数、水溶性和亨利常数（k_H）等影响电荷态和加合物形成。挥发性HFIP可使电荷包络向高电荷态移动；少量甘氨酸添加可在不损害分离的情况下增强电离并维持系统稳定性。

4 案例研究：IP-RPLC-MS策略用于ON分析
4.1 单链ON杂质谱分析
单链ONs与其杂质间微小结构差异是杂质谱分析的主要挑战。对于PO、PS或脱氨等同骨架杂质，可利用疏水性差异并优先采用弱IPRs；对于短链和长链等长度差异杂质，增强静电作用并优先采用强IPRs。CNET异构体可在丙胺系统中分离，脱氨变异体可达1%水平基线分离，且保留效应具位点依赖性；脱氨杂质质量差仅0.98 Da时需高分辨质谱或良好色谱分离，S1核酸酶自下而上酶解可放大相对质量差。利用“开-关”保留特征，短柱和陡梯度可实现高通量分析，如21-mer RNA与20种短链杂质在30 s内分离；2D IP-RPLC可直接与MS联用，克服一维AEX或SEC与MS不兼容的问题，但紧密相关物种分辨仍需长柱和浅梯度。中度烷基胺DIPEA可降低“开-关”效应，多柱偶联可提高峰容量。疏水IPRs溶解度有限，流动相近中性易滋生细菌，加入有机溶剂可改善溶解性并抑制细菌生长。

4.2 新型配体偶联ONs分析
配体偶联可增强ONs靶向递送。N-乙酰半乳糖胺（N-acetyl-galactosamine, GalNAc）偶联可提高肝脏递送并降低促炎反应；脂肪酸偶联有助于肝外组织分布；肽和小分子偶联受靶标亲和力及清除速度限制；抗体-寡核苷酸偶联物（antibody–oligonucleotide conjugates, AOCs）具高特异性但尚无临床获批产品。IP-RPLC中GalNAc等亲水偶联对保留影响较小，脂质修饰ONs（lipid-modified oligonucleotides, LONs）则因额外疏水作用而保留增强。采用弱IPR结合MALDI-TOF-MS可分析5′或3′端二十二烷基偶联单链ONs并分离多达19种杂质；LONs可出现短链种类保留长于全长产物的反长度洗脱趋势，提示偶联基团疏水作用主导保留。肽-寡核苷酸偶联物（peptide–oligonucleotide conjugates, POCs）分离中，BAA系统在宽孔C₁₈柱和80°C条件下优于TEAA和DIPEAA，但该方法不适用于缺乏负电荷的肽核酸等ONs。环肽-siRNA可在2D-LC中采用变性IP-RPLC-MS，实现约1%水平杂质分离和MS解析。

4.3 siRNA双链的非变性分析
siRNA双链非变性分析旨在评估残留单链杂质。双链杂交与解链在样品溶液中处于动态平衡，受固定相化学、流动相添加剂、一级序列和化学修饰影响。熔解温度（T_m）定义为50%双链和50%单链时的温度，表观T_m受反离子浓度和性质影响，稳定顺序大致为DIPEA⁺ ＜ TEA⁺ ＜ HA⁺ ＜ Cs⁺ ＜ K⁺ ＜ Na⁺ ＜ NH₄⁺ ＜ Li⁺；甲醇、ACN和HFIP等有机溶剂降低双链稳定性。分离应在远低于T_m的温度下进行，以避免部分解链导致峰拖尾或展宽。IP-RPLC通常变性效应较强，但已有非变性条件报道；AEX和SEC一般视为非变性技术，固定相疏水性亦影响双链完整性。采用15 mM HA和50 mM HFIP可实现siRNA双链相关短链、长链和PO杂质的基线分离；双链在LC中保持完整，但MS因ESI源温度主要检测两条单链，正离子模式下高m/z（＞2000 Da）仍可观察到完整双链质量。

5 无离子对RPLC-MS方法
IPRs会污染LC-MS系统并在正离子ESI中抑制信号，氟醇还引发全氟和多氟烷基物质（PFAS）形成担忧，因此无IPR/HFIP的RPLC方法受到关注。无IPRs时ONs在C₁₈柱上保留低，长度分离通常劣于IP-RPLC；MS虽可提供灵敏度，但共洗脱物可造成离子抑制，且难以区分同量异位或同位素包络重叠杂质。当前研究聚焦HILIC或定制固定相化学。苯基固定相保留可由π–π作用、分子内碱基堆积、疏水效应和二级结构共同驱动，联苯、二苯基和五氟苯基固定相可改善长度分离选择性。SG-AP和SG-CHOL固定相通过氢键和疏水作用可分离patisiran类似物与多种短链杂质，但对部分关键杂质分辨有限，可采用HILIC-MS二维策略。烷基化策略可选择性修饰PS键以增大PO/PS疏水差异；硅烷化衍生化针对消化释放的P–OH，但限于脱氨分析。无离子对RPLC适用于疏水偶联ONs，LONs与其短链杂质的分离效率可与IP-RPLC相当，且保留顺序可因强疏水偶联基团而反转；长疏水链偶联siRNA如自组装胶束抑制性RNA（self-assembled micelle inhibitory RNA, SAMiRNA）已可通过IP-free RPLC-MS分离ASO、正义链及完整双链，RPLC亦可在调节盐浓度和低温下为疏水偶联siRNA提供非变性条件。

6 结论
IP-RPLC-MS仍是治疗性ONs表征的基准技术。单链ONs杂质谱分析的有效优化依赖于对杂质与目标ONs理化差异的理解，并据此选择IPRs和反离子以平衡疏水与静电作用；固定相作用相对流动相添加剂较小，C₁₈柱结合生物惰性硬件是可靠起点。siRNA双链非变性分析还需优化流动相添加剂、固定相化学和柱温，以在保持双链状态的同时获得足够分离。无离子对RPLC因固定相和衍生化进展而改善，但仍未充分探索，分离性能落后于IP-RPLC-MS；其有望缓解IPR造成的MS信号抑制和系统污染问题。