骨髓间充质干细胞来源外泌体miR-451a通过TLR4/PI3K/AKT信号通路抑制巨噬细胞M1极化减轻急性肺损伤

《Stem Cells International》：Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomal miR-451a Inhibits Macrophage M1 Polarization Through the TLR4/PI3K/AKT Signaling Pathway to Alleviate Acute Lung Injury

　　

背景：巨噬细胞向M1表型的异常极化是急性肺损伤（ALI）的关键致病机制。骨髓间充质干细胞（MSC）来源的外泌体（BMSC-Exos）是一种有前景的治疗方法，可抑制巨噬细胞M1极化并减轻ALI，但其涉及的分子介质尚未完全明确。本研究旨在鉴定负责的外泌体介质并明确其下游信号传导。 方法：通过气管内滴注脂多糖（LPS）建立ALI小鼠模型，并使用LPS刺激的RAW264.7细胞构建细胞损伤模型。从人BMSCs中分离外泌体。通过HE染色、肺湿干重比、支气管肺泡灌洗液（BALF）蛋白浓度和BALF总细胞计数评估肺损伤。采用RT-qPCR、蛋白质印迹法、酶联免疫吸附测定（ELISA）和免疫荧光评估相关基因和蛋白的表达水平。 结果：BMSC-Exos治疗显著改善了ALI小鼠的肺损伤，降低了肺湿干重比、BALF蛋白浓度和总炎症细胞计数。此外，BMSC-Exos降低了M1型巨噬细胞标志物（iNOS、CD80和CD86）及促炎细胞因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）的表达，从而抑制了巨噬细胞M1极化。机制上，BMSC-Exos抑制了LPS诱导的PI3K/AKT信号通路激活，而PI3K/AKT激活剂740 Y-P削弱了BMSC-Exos对M1极化的抑制作用。miR-451a的表达在ALI中显著下调，并在BMSC-Exos中富集。miR-451a通过靶向并抑制Toll样受体4（TLR4）表达来抑制PI3K/AKT信号通路。敲低miR-451a或过表达TLR4减弱了BMSC-Exos对ALI的治疗效果。 结论：BMSC-Exos来源的miR-451a通过下调TLR4表达抑制PI3K/AKT信号通路，从而抑制巨噬细胞M1极化并减轻ALI。

论文解读：骨髓间充质干细胞来源外泌体miR-451a通过TLR4/PI3K/AKT信号通路抑制巨噬细胞M1极化减轻急性肺损伤

一、研究背景与目的

急性肺损伤（ALI）是一种由肺部因素（如肺创伤、肺炎）或肺外因素（如脓毒症、输血超负荷）诱发的急性呼吸系统疾病，其特征为急性低氧性呼吸衰竭，伴有肺泡上皮和毛细血管内皮损伤、炎症细胞浸润、毛细血管通透性增加和肺积液。若未得到及时有效的干预，ALI可进展为急性呼吸窘迫综合征（ARDS），甚至导致多器官功能衰竭。既往研究强调了促炎性巨噬细胞极化在ALI发病机制中的关键作用，M1样巨噬细胞分泌的大量促炎细胞因子和蛋白酶会加剧肺组织损伤。因此，探索抑制巨噬细胞M1极化的策略对于治疗ALI具有重要意义。

间充质干细胞（MSCs）已被证实能够调节免疫反应和炎症，在呼吸系统疾病中发挥重要作用。然而，MSCs的应用仍存在安全性、细胞效力标准化检测及临床实际应用等未解决的问题。相比之下，来源于MSCs的外泌体（Exos）具有低免疫原性、无致瘤性和储存成本低等多种优势。已有研究表明，骨髓MSCs（BMSCs）来源的外泌体（BMSC-Exos）可促进巨噬细胞M2极化、减少炎症并减轻LPS诱导的ALI大鼠病理损伤。PI3K/AKT信号通路是细胞内核心的生存信号轴，在调节细胞存活、增殖和代谢中起关键作用，且可能调控炎症、凋亡和氧化应激以改善ALI。然而，BMSC-Exos与PI3K/AKT信号在ALI巨噬细胞极化过程中的关系尚不明确。因此，本研究利用LPS处理的小鼠和RAW264.7巨噬细胞建立了体内和体外ALI模型，旨在进一步探讨BMSC-Exos在ALI中对巨噬细胞极化的调控作用及其分子机制。

二、主要技术方法

研究人员采用了多种关键技术方法。首先，通过超速离心结合外泌体分离试剂盒从人BMSCs培养基中提取外泌体，并使用纳米颗粒追踪分析（NTA）和透射电子显微镜（TEM）进行表征。其次，通过气管注射LPS（来自大肠杆菌O111:B4，剂量5 mg/kg）构建C57BL/6J小鼠ALI模型，并通过尾静脉注射给予BMSC-Exos（每只动物总剂量2 μg外泌体蛋白）。细胞实验中使用LPS（1 μg/mL）刺激小鼠单核-巨噬细胞RAW264.7细胞系（购自中国科学院上海细胞库）建立损伤模型。研究还使用了PI3K/AKT通路激活剂740 Y-P、miR-451a抑制剂以及慢病毒介导的TLR4过表达（OE-TLR4）载体。此外，利用双荧光素酶报告基因实验验证miR-451a与TLR4的直接结合，并重新分析了NCBI GEO数据库中的两个公开数据集（GSE147138和GSE229262）进行生物信息学分析。

三、研究结果

3.1 BMSC-Exos抑制小鼠ALI

成功分离并鉴定了BMSC-Exos（呈典型杯状形态，直径30-150 nm，表达CD63、alix、TSG101，不表达calnexin和GM130）。与LPS组相比，BMSC-Exos治疗组小鼠的肺泡结构破坏、水肿、增厚和炎症细胞浸润等病理损伤显著减轻，肺湿干重比、BALF蛋白浓度和BALF总细胞数显著降低，BALF中促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平也显著下降。

3.2 BMSC-Exos抑制M1型巨噬细胞极化

PKH-26标记实验证实巨噬细胞可摄取BMSC-Exos。与LPS组相比，BMSC-Exos处理显著降低了ALI小鼠肺组织和LPS刺激的RAW264.7细胞中M1型巨噬细胞标志物（iNOS、CD80和CD86）的mRNA和蛋白表达水平，并减少了细胞上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌。

3.3 BMSC-Exos通过抑制PI3K/AKT信号通路活性来抑制巨噬细胞M1极化

LPS处理显著增加了p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT的比值，表明PI3K/AKT通路被激活；而BMSC-Exos处理则显著降低了这些比值。加入PI3K/AKT通路激活剂740 Y-P后，逆转了BMSC-Exos对通路活性的抑制作用，并削弱了BMSC-Exos对M1标志物表达和促炎因子产生的抑制效果。

3.4 BMSC-Exos来源的miR-451a通过抑制PI3K/AKT信号通路抑制巨噬细胞M1极化

生物信息学分析发现，在ALI中表达显著降低的miR-451a在BMSC-Exos中高度富集。用miR-451a抑制剂转染BMSCs后提取的外泌体（inhibitor-BMSC-Exos）与LPS刺激的巨噬细胞共培养，结果显示，与BMSC-Exos组相比，inhibitor-BMSC-Exos组显著增加了p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT的比值，并上调了M1标志物和促炎因子的表达，表明敲低miR-451a削弱了BMSC-Exos的抑制作用。

3.5 miR-451a通过靶向TLR4抑制PI3K/AKT信号通路

通过starBase数据库预测并与ALI mRNA数据集GSE229262取交集，筛选出TLR4作为候选靶基因。体内外实验均证实LPS处理后TLR4表达升高。双荧光素酶报告基因实验证实miR-451a可直接与TLR4的3‘UTR结合。过表达miR-451a mimic可抑制TLR4表达及PI3K/AKT通路活性，而过表达TLR4则可部分逆转miR-451a mimic的这些效应。

3.6 BMSC-Exos来源的miR-451a通过抑制TLR4/PI3K/AKT信号通路减轻小鼠ALI

在ALI小鼠模型中，与BMSC-Exos组相比，注射miR-451a敲低的BMSC-Exos或同时过表达TLR4均逆转了BMSC-Exos对肺组织病理损伤、肺湿干重比、BALF蛋白浓度和总细胞数的改善作用，并恢复了TLR4、p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT的表达水平，同时上调了M1标志物（iNOS、CD80、CD86）和促炎因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）的水平。

四、讨论与结论

本研究表明，BMSC-Exos可通过抑制PI3K/AKT信号通路活性来抑制巨噬细胞M1极化，从而改善小鼠ALI。进一步的机制研究发现，BMSC-Exos中富集的miR-451a通过下调TLR4表达来抑制PI3K/AKT信号通路。然而，抑制miR-451a表达或过表达TLR4均可逆转BMSC-Exos的积极作用。这些发现为MSC来源外泌体在ALI中的靶向应用提供了机制基础。尽管本研究揭示了BMSC-Exos-miR-451a/TLR4/PI3K/AKT分子轴在ALI巨噬细胞极化中的调控作用，但仍存在局限性：机制实验仅在RAW264.7细胞系中进行，未来需在原代细胞中验证；且miR-451a可能存在多个靶基因的协同效应，有待进一步研究。

研究结论： BMSC-Exos来源的miR-451a通过下调TLR4表达抑制PI3K/AKT信号通路，从而抑制巨噬细胞M1极化并减轻ALI。