《Stem Cells International》：Astaxanthin Inhibits ox-LDL-Induced Early Endothelial Progenitor Cells Oxidative Stress and Apoptosis Through Nrf2 Activation
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虾青素对干细胞凋亡具有强大的保护作用。本研究探讨了虾青素对氧化型低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein, ox-LDL）诱导的内皮祖细胞（endothelial progenitor cells, EPCs）氧化应激和凋
虾青素对干细胞凋亡具有强大的保护作用。本研究探讨了虾青素对氧化型低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein, ox-LDL）诱导的内皮祖细胞（endothelial progenitor cells, EPCs）氧化应激和凋亡的保护功效。体外培养的人早期EPCs在添加或不添加虾青素的条件下暴露于ox-LDL。结果显示，ox-LDL暴露显著降低了EPCs中核因子E2相关因子2（nuclear factor-E2-related factor 2, Nrf2）的核转位，同时增加了氧化应激和凋亡率。虾青素预处理减弱了ox-LDL诱导的活性氧（reactive oxygen species, ROS）生成和EPCs凋亡，保持了线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential, MMP），并伴随增强了细胞核Nrf2积聚，同时上调了NQO1、HO-1和谷胱甘肽（glutathione, GSH）水平。Nrf2小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）介导的敲低完全消除了虾青素诱导的NQO1和HO-1上调。在机制上，虾青素促进了Akt磷酸化（激活）并抑制了糖原合酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β, GSK-3β）磷酸化。用LY294002（一种磷酸肌醇3-激酶/phosphoinositide 3-kinase, PI3K抑制剂）预处理抑制了虾青素诱导的Nrf2核转位，加剧了ROS产生，并降低了NQO1和GSH水平。此外，虾青素阻断了ox-LDL诱导的caspase-3上调，并保持了EPCs的迁移和管形成能力。Nrf2 siRNA消除了虾青素对EPCs ROS产生、MMP保持、凋亡和迁移的保护作用；管形成能力未进行评估。总体而言，这些使用健康供体细胞的体外研究结果为虾青素在PI3K/Akt/GSK-3/Nrf2通路中的潜在作用提供了机制支持。然而，由于本研究仅限于体外结果，虾青素在动脉粥样硬化性疾病预防和治疗中的应用仍需在疾病相关模型和临床研究中进一步验证。
**一、研究背景与目的**
心血管疾病（cardiovascular diseases, CVDs）是全球范围内导致死亡的首要原因，约占全世界总死亡人数的三分之一。在诸多致病因素中，血脂异常，尤其是血浆低密度脂蛋白（low-density lipoprotein, LDL）及其氧化衍生物氧化型低密度脂蛋白（oxidized LDL, ox-LDL）在动脉粥样硬化的发生、进展及斑块失稳中发挥关键作用。ox-LDL通过过量产生活性氧（reactive oxygen species, ROS）并激活氧化应激信号通路，对内皮细胞和骨髓来源干细胞造成功能性损伤，从而损害内皮修复过程。内皮祖细胞（endothelial progenitor cells, EPCs）是骨髓来源祖细胞中能够分化为成熟内皮细胞的亚群，在内皮再生、血管稳态维持和损伤后血管修复中发挥关键作用。然而，ox-LDL暴露会剂量依赖性地损害EPCs的增殖、迁移和血管生成能力，并加速细胞衰老和凋亡。因此，寻找能够保护EPCs免受ox-LDL诱导损伤的干预策略具有重要的治疗潜力。
虾青素是一种天然的非维生素A原类胡萝卜素，富含于甲壳类动物、鲑科鱼类和海星的红色色素中。其独特的化学结构——具有极性末端基团和两个含氧部分——赋予其强大的ROS淬灭活性，抗氧化能力显著高于β-胡萝卜素、α-生育酚等常见抗氧化剂。除直接清除单线态氧和自由基外，虾青素还通过上调内源性抗氧化基因表达、改善线粒体功能和抑制促炎信号发挥细胞保护作用。已有研究表明虾青素可保护干细胞和内皮细胞免受氧化应激诱导的功能障碍和凋亡，并通过抑制LDL氧化、减少血管氧化损伤和限制血管壁脂质沉积来预防动脉粥样硬化。核因子E2相关因子2（nuclear factor-E2-related factor 2, Nrf2）是调控细胞抗氧化和解毒反应的关键转录因子，通过与靶基因启动子区域的抗氧化反应元件（antioxidant response element, ARE）结合，调控NAD(P)H醌氧化还原酶1（NQO1）、血红素加氧酶-1（HO-1）和谷胱甘肽（GSH）合成酶等基因的表达。然而，虾青素是否能够保护EPCs免受ox-LDL诱导的损伤，以及该保护作用是否通过PI3K/Akt/GSK-3通路介导的Nrf2激活实现，尚不完全清楚。本研究旨在评估虾青素对ox-LDL介导的EPCs氧化应激、凋亡和功能损伤的保护作用，并探究涉及PI3K/Akt/GSK-3通路和Nrf2激活的潜在分子机制。
**二、研究内容与主要结论**
研究人员从健康志愿者外周血中分离外周血单个核细胞，经体外培养获得人早期EPCs，并通过形态学观察、Dil-ac-LDL摄取、UEA-I结合和流式细胞术进行表型鉴定。实验设计包括对照组、ox-LDL处理组（20 μg/mL，24 h）、虾青素预处理组（10、50或100 μg/mL，6 h预处理后再暴露于ox-LDL）、Nrf2 siRNA转染组和LY294002（PI3K抑制剂）预处理组。研究得出以下主要结论：虾青素通过激活PI3K/Akt/GSK-3通路，促进Nrf2核转位，上调NQO1和HO-1表达，恢复GSH水平，从而减轻ox-LDL诱导的氧化应激、线粒体功能障碍、凋亡以及迁移和血管生成功能损伤。这些发现揭示了虾青素心血管保护作用的新机制，为其在动脉粥样硬化性疾病防治中的应用提供了理论依据。
**三、主要技术方法**
本研究采用的主要技术方法包括：从健康志愿者外周血中分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs），经Ficoll密度梯度离心后接种于纤连蛋白包被的培养板中，7天获得早期EPCs并鉴定其表型（CD34、CD133、VEGFR2/KDR阳性率均超过90%）。采用DCFH-DA和DHE荧光探针检测细胞内ROS水平，JC-1染色评估线粒体膜电位（ΔΨm），ELISA法测定细胞内GSH含量。通过DAPI染色和Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术定量细胞凋亡率。使用Western blot检测细胞质和细胞核中Nrf2蛋白分布、NQO1/HO-1蛋白表达、Akt和GSK-3β磷酸化水平以及cleaved caspase-3表达；RT-PCR检测NQO1和HO-1 mRNA水平。通过Nrf2 siRNA转染进行基因敲低验证Nrf2依赖性；使用PI3K抑制剂LY294002验证信号通路上游调控关系。采用Transwell迁移实验和Matrigel管形成实验评估EPCs功能。实验采用多个独立供体样本进行，数据以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）和Tukey事后检验。
**四、研究结果**
**4.1 早期EPC形态学及表型鉴定**
从健康志愿者（8例独立供体，平均年龄31.3岁，3男5女）外周血中分离PBMCs，经7天体外培养后，贴壁细胞呈现早期EPCs典型的梭形（类成纤维细胞）和鹅卵石样（类内皮细胞）两种形态。超过90%的贴壁细胞同时摄取Dil-ac-LDL（红色荧光）并结合FITC-UEA-I（绿色荧光）。流式细胞术检测显示CD34、CD133和VEGFR2/KDR阳性率分别为（95.5±2.4）%、（93.4±1.8）%和（90.7±2.8）%，确认所获细胞为早期EPCs。
**4.2 虾青素减轻ox-LDL诱导的早期EPCs氧化应激**
荧光显微镜和流式细胞术检测结果显示，ox-LDL处理显著增加细胞内ROS水平，而虾青素（10、50或100 μg/mL）预处理剂量依赖性地抑制了ROS升高。JC-1染色显示ox-LDL处理导致线粒体去极化（红色/绿色荧光比值降低），虾青素预处理显著恢复MMP。ELISA检测显示ox-LDL处理显著降低GSH含量，而10和50 μg/mL虾青素预处理显著逆转了这一降低。Nrf2 siRNA干预可逆转虾青素对ROS、MMP和GSH的上述保护效应。
**4.3 虾青素抑制ox-LDL诱导的早期EPCs凋亡**
DAPI染色显示ox-LDL处理导致细胞皱缩和核固缩等凋亡形态学改变，凋亡细胞比例从对照组的4.1±0.5%升高至13.5±1.3%。Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术显示ox-LDL处理使总凋亡率从3.8±0.8%（对照组）升高至16.2±2.4%，虾青素预处理将其显著降低至5.7±1.6%。Nrf2 siRNA预处理可逆转虾青素的抗凋亡效应。
**4.4 虾青素促进早期EPCs中Nrf2核转位**
Western blot结果显示，ox-LDL处理显著降低细胞核内Nrf2蛋白水平（为对照的0.44±0.05倍），而虾青素（10或50 μg/mL）预处理显著增加核内Nrf2积聚（分别为ox-LDL单独处理组的1.91±0.18倍和2.69±0.23倍）。核/质Nrf2比值分析进一步证实虾青素促进Nrf2核转位而非调控其转录合成。
**4.5 虾青素通过Nrf2依赖性机制上调NQO1和HO-1表达**
Western blot和RT-PCR检测显示，ox-LDL处理显著下调NQO1和HO-1的蛋白和mRNA水平。虾青素预处理剂量依赖性地逆转了这一下调。Nrf2 siRNA转染有效敲低Nrf2蛋白水平（为阴性对照siRNA的0.24±0.06倍），并完全消除虾青素诱导的NQO1和HO-1 mRNA及蛋白表达上调，证实虾青素对NQO1和HO-1的诱导依赖于Nrf2。
**4.6 虾青素通过PI3K/Akt/GSK-3通路激活Nrf2**
Western blot检测显示，虾青素处理显著增加Akt磷酸化水平（p-Akt/Akt比值为对照的3.23±0.21倍和3.85±0.10倍）并抑制GSK-3β（Tyr-216）磷酸化（p-GSK-3/GSK-3比值为对照的0.38±0.04倍和0.32±0.05倍），提示激活PI3K/Akt通路并抑制GSK-3活性。PI3K抑制剂LY294002预处理显著降低虾青素诱导的NQO1和HO-1 mRNA水平及GSH生成，证实虾青素主要通过PI3K/Akt/GSK-3通路激活Nrf2信号。
**4.7 虾青素抑制ox-LDL诱导的caspase-3激活**
Western blot结果显示，ox-LDL处理显著增加cleaved caspase-3蛋白水平（为对照的1.83±0.13倍），而50 μg/mL虾青素预处理部分但显著地阻断了这一上调（降至对照的1.32±0.09倍），提示虾青素的抗凋亡作用部分通过抑制caspase-3激活介导。
**4.8 虾青素保护ox-LDL诱导的早期EPCs迁移和管形成功能损伤**
Transwell迁移实验显示ox-LDL处理使迁移细胞数从对照组的107±8降至58±4，虾青素预处理恢复至109±6，Nrf2 siRNA可逆转虾青素对迁移的保护作用。Matrigel管形成实验显示ox-LDL严重损害EPCs血管生成能力（总管长度从113±9 mm/field降至37±4 mm/field，分支数从31±2降至10±2），虾青素预处理显著恢复管形成能力（总长度97±8 mm/field，分支数28±3）。Nrf2敲低对管形成的影响未进行评估。
**五、讨论与结论**
本研究表明ox-LDL暴露通过抑制Nrf2核转位、下调NQO1/HO-1表达和耗竭GSH破坏EPCs的抗氧化防御系统，同时诱导线粒体去极化和caspase-3激活，造成EPCs凋亡和功能损伤。虾青素预处理通过激活PI3K/Akt/GSK-3通路，磷酸化Akt并抑制GSK-3β活性，从而促进Nrf2核转位，上调ARE驱动的抗氧化基因表达，恢复GSH水平，打破氧化应激与线粒体功能障碍之间的恶性循环。Nrf2 siRNA敲低实验和LY294002抑制实验从正反两方面证实了该信号通路的因果性。研究局限性包括：实验仅基于健康供体来源的人早期EPCs的体外数据，不能直接外推至动脉粥样硬化患者的复杂病理状态；未探讨NF-κB和MAPK等其他可能参与的信号通路；体内给药的最适浓度和疗程尚需考虑生物利用度和组织分布等因素进一步优化。综上所述，研究人员得出以下结论：虾青素通过激活PI3K/Akt/GSK-3通路，促进Nrf2核转位，增强内源性抗氧化防御系统，保护早期EPCs免受ox-LDL诱导的氧化应激、凋亡和功能损伤。这些结果揭示了虾青素心血管保护作用的新机制；然而，考虑到体外数据的固有局限性，虾青素在动脉粥样硬化性心脑血管疾病预防中的临床应用尚需进一步体内研究和临床试验验证其在动脉粥样硬化患者中增强EPCs功能和促进血管健康的安全性与有效性。
