《MEDIATORS OF INFLAMMATION》：Effect of Gynostemma pentaphyllum on Ulcerative Colitis by Regulating the PI3K-AKT Signaling Pathway
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本研究采用网络药理学预测与体外细胞实验相结合的方法，初步探究绞股蓝（Gynostemma pentaphyllum, GP）治疗溃疡性结肠炎（ulcerative colitis, UC）的药理机制。通过全面的数据库检索，共鉴定出GP的15个活性化合物，涵盖1
本研究采用网络药理学预测与体外细胞实验相结合的方法，初步探究绞股蓝（Gynostemma pentaphyllum, GP）治疗溃疡性结肠炎（ulcerative colitis, UC）的药理机制。通过全面的数据库检索，共鉴定出GP的15个活性化合物，涵盖173个潜在靶点，同时识别出4218个UC相关靶点，最终获得136个共同靶点。利用STRING数据库构建蛋白质相互作用网络，并采用Metascape数据库进行基因本体（Gene Ontology, GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）富集分析。使用AutoDock软件进行分子对接验证，评估主要活性成分与核心靶点之间的相互作用。体外实验采用脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）诱导的Caco-2细胞模型，通过细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8, CCK-8）法评估细胞活力，采用酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）检测IL-6和TNF-α水平，并利用蛋白质印迹法分析总PI3K和Akt蛋白的表达。研究结果表明，网络药理学分析鉴定出10个核心靶点，包括AKT1、TNF、IL6、TP53和IL1B。KEGG富集分析提示PI3K-Akt、MAPK、TNF和IL-17等信号通路参与GP干预UC的过程。分子对接显示，主要活性成分（芦丁素、槲皮素和异岩藻甾醇）与AKT1、TNF、IL6和TP53等靶蛋白具有较强结合亲和力。细胞实验表明，单剂量GP处理后，LPS诱导的Caco-2细胞中IL-6和TNF-α水平降低，同时PI3K和Akt总蛋白表达发生改变。需要注意的是，本研究未检测磷酸化蛋白，因此无法确定PI3K-Akt通路的活性状态。此外，使用单一细胞系和单一剂量限制了研究结果向体内情况的推广。总之，GP对UC的潜在治疗作用可能涉及多靶点、多通路的复杂机制。本研究提供了初步的体外实验证据，并为后续深入研究提出了可检验的科学假说。
背景与问题：溃疡性结肠炎（ulcerative colitis, UC）是一种主要累及结肠和直肠的慢性炎症性肠病，临床上以血性黏液便、腹痛和腹泻为主要特征，具有难治性强、复发率高及癌变风险增加等特点。2023年全球UC患病率估计达500万例，且发病率呈逐年上升趋势。目前UC的临床药物治疗主要包括氨基水杨酸制剂、糖皮质激素和免疫抑制剂等，但常伴随明显不良反应，因此亟需开发生物利用度更高、全身毒性更低的新型治疗策略。传统中医药（traditional Chinese medicine, TCM）在UC治疗中展现出显著潜力。绞股蓝（Gynostemma pentaphyllum, GP）属葫芦科植物，作为药食两用草药被广泛应用，含有皂苷、黄酮、多糖和氨基酸等活性成分，具有抗炎、抗癌、降脂、降糖和心脏保护等多重药理作用。然而，GP治疗UC的具体分子机制尚未完全阐明，有必要采用现代药理学研究手段进行系统探索。
研究内容与结论：本研究整合网络药理学预测与体外细胞实验，对GP治疗UC的潜在机制进行了初步探究。通过网络药理学筛选获得GP的15个活性成分及其173个潜在靶点，与4218个UC相关靶点取交集获得136个共同靶点，进一步构建蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI）网络并鉴定出10个核心靶点，包括AKT1、TNF、IL6、TP53、IL1B、CASP3、PTGS2、JUN、EGFR和MMP9。基因本体（Gene Ontology, GO）富集分析显示GP可能通过调节氧化应激反应、外源刺激应答和伤口愈合等生物学过程发挥作用。京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）富集分析提示磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（PI3K-Akt）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、肿瘤坏死因子（TNF）和白细胞介素-17（IL-17）等信号通路参与GP干预UC的过程。分子对接结果显示主要活性成分鼠李秦素、槲皮素和异岩藻甾醇与AKT1、TNF、IL6和TP53等靶蛋白具有强结合亲和力（结合能均低于-5 kcal·mol?1）。体外实验中，研究人员采用脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）诱导的人结直肠腺癌细胞系Caco-2作为UC细胞模型，设对照组、模型组（10 μg/mL LPS）和GP组（10 μg/mL LPS联合200 μg/mL GP）。细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8, CCK-8）检测显示GP干预可改善LPS导致的细胞活力下降。酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）结果表明GP处理显著降低LPS诱导的IL-6和TNF-α水平升高。蛋白质印迹（western blot）检测显示GP处理降低PI3K和Akt总蛋白表达，同时升高糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）蛋白水平，提示GP可能通过调控PI3K/Akt/GSK-3β通路发挥抗炎作用。该研究为GP治疗UC提供了初步的体外实验证据，并提出了有待进一步验证的科学假说。
主要技术方法：本研究采用的技术路线包括：（1）基于TCMSP数据库筛选GP活性成分（口服生物利用度OB≥30%，类药性DL≥0.18），通过UniProt数据库进行靶点映射；（2）整合GeneCards、OMIM、DisGeNET和DrugBank数据库获取UC疾病靶点，取交集获得药物-疾病共同靶点；（3）利用STRING 11.0数据库构建PPI网络，Cytoscape 3.7.2进行可视化与核心靶点筛选；（4）通过DAVID数据库进行GO和KEGG富集分析；（5）采用AutoDock软件对主要活性成分与核心靶点进行分子对接验证；（6）体外实验使用Caco-2细胞系（购自武汉普诺赛生命科技有限公司），以LPS诱导炎症模型，GP提取物（采自山东大学第二医院中药饮片，经95%乙醇-水回流提取获得冻干粉）进行干预，采用CCK-8法检测细胞活力、ELISA检测IL-6和TNF-α水平、western blot检测PI3K、Akt和GSK-3β蛋白表达。
研究结果：
3.1 网络药理学分析
3.1.1 GP治疗UC相关靶点的鉴定：研究人员通过数据库检索和靶点映射，鉴定出GP中15个活性成分均满足OB≥30%和DL≥0.18的筛选标准，这些成分共对应173个相关靶点；UC相关的疾病靶点为4218个，药物与疾病靶点取交集后获得136个共同靶点。
3.1.2 活性成分-靶点作用网络的构建：利用STRING 11.0数据库对GP和UC共同靶点进行PPI网络分析。网络拓扑分析显示鼠李秦素、槲皮素和异岩藻甾醇具有较高的中心性。按度值降序排列，前10位核心靶点为AKT1（度值115）、TNF（110）、IL6（108）、TP53（106）、IL1B（100）、CASP3（98）、PTGS2（97）、JUN（97）、EGFR（95）和MMP9（95），提示这些靶点可能是GP治疗UC的关键作用靶点。通过Cytoscape构建了药物-成分-靶点-疾病网络图。
3.1.3 GO分析和KEGG通路分析：GO富集分析显示GP可能通过调节氧化应激反应、外源刺激应答和伤口愈合等生物学过程发挥治疗作用；细胞组分方面富集于转录调节复合物、膜微区和膜筏等；分子功能层面涉及多种结合活性。KEGG通路富集分析显示PI3K-Akt、MAPK、TNF和IL-17等信号通路是GP发挥治疗作用的重要途径。
3.1.4 分子对接：研究人员选取AKT1、TNF、IL6和TP53四个核心靶蛋白与鼠李秦素、槲皮素和异岩藻甾醇三种活性成分进行分子对接验证。结果显示所有结合能均低于-5 kcal·mol?1（槲皮素与TNF结合能达-8.4 kcal·mol?1，异岩藻甾醇与TP53结合能为-7.9 kcal·mol?1），表明活性成分与核心靶点之间具有较强的结合亲和力，验证了网络药理学预测的可靠性。
3.2 GP对LPS刺激的Caco-2细胞中PI3K-Akt信号通路的调节
3.2.1 细胞活力：CCK-8检测结果显示，与对照组相比，模型组（10 μg/mL LPS处理）细胞光密度显著降低，表明细胞活力下降；GP干预组细胞增殖活性相对模型组明显增强，说明200 μg/mL GP处理可改善LPS对Caco-2细胞的损伤作用。
3.2.2 GP降低促炎细胞因子IL-6和TNF-α的水平：ELISA结果显示，模型组IL-6浓度（4.951±0.525 pg/mL）较对照组（1.452±0.150 pg/mL）显著升高（p<0.001）；经GP处理后，IL-6水平降至2.322±0.267 pg/mL（p<0.01），但仍高于对照组。TNF-α呈相似趋势，模型组浓度（13.27±0.858 pg/mL）较对照组（3.414±0.646 pg/mL）显著升高（p<0.001），GP处理后降至7.582±0.405 pg/mL（p<0.01）。结果表明GP可有效抑制LPS诱导的促炎细胞因子产生。
3.2.3 GP降低PI3K和Akt蛋白表达水平的同时升高GSK-3β表达：蛋白质印迹结果显示，与对照组相比，模型组PI3K和Akt蛋白水平升高，而GSK-3β水平降低；GP处理组与模型组相比，PI3K和Akt蛋白表达显著下降，GSK-3β蛋白表达明显回升。这一结果表明GP可能通过调节PI3K/Akt/GSK-3β信号通路相关蛋白的表达来减轻炎症反应。
讨论：过度产生的IL-6和TNF-α与UC的炎症进程密切相关。研究已知IL-6可通过PI3K/Akt信号通路选择性抑制GSK3β活性，从而加重炎症反应。GSK3β在调节促炎和抗炎细胞因子产生中发挥关键作用，其失活可增强抗炎细胞因子产生并抑制IL-6和TNF-α等促炎细胞因子。本研究中GP处理降低了IL-6和TNF-α水平、升高GSK3β总蛋白水平、降低PI3K和Akt总蛋白水平，提示GP可能通过调控该信号通路相关蛋白发挥抗炎效应。研究人员指出本研究存在局限性：未检测磷酸化蛋白（p-PI3K、p-Akt和p-GSK3β），无法确定通路真实活性状态；仅使用Caco-2单一细胞系，不能完全模拟体内肠道的复杂微环境；仅采用单一剂量（200 μg/mL）且未设阳性药物对照，无法评估剂量-效应关系。因此本研究属于初步的探索性体外研究，其主要贡献在于建立网络药理学预测验证的初步框架，并提出了GP可能通过调节PI3K/AKT/GSK3β通路相关总蛋白发挥抗炎作用的可检验假说。未来研究应借助DSS诱导小鼠结肠炎模型验证体内药效并检测磷酸化蛋白水平，设立多个浓度梯度和阳性对照组，必要时构建肠上皮细胞与免疫细胞共培养体系或进行肠道菌群分析，并结合转录组学或蛋白质组学对136个共同靶点进行系统验证。
结论：本研究整合网络药理学和Caco-2细胞实验，初步探讨了GP治疗UC的潜在机制。结果表明GP可降低LPS诱导的Caco-2细胞中IL-6和TNF-α的表达水平，并调节PI3K/AKT/GSK3β信号通路相关总蛋白的表达。该研究为GP的抗炎特性提供了初步的体外实验证据。然而，由于缺乏磷酸化蛋白检测和仅使用单一细胞系，这些结论不能直接外推至体内情况。后续需要通过动物实验和更全面的机制研究来进一步验证GP作为UC候选药物的治疗潜力。
