液体活检在过去二十年间已从组织基因分型的延伸手段，演变为一种微创方法，可用于癌症全程中的重复性和纵向分子评估。测序技术、数字聚合酶链反应（digital PCR）、错误抑制策略以及计算分析技术的进步，已将分析物从循环肿瘤DNA（ctDNA）和循环肿瘤细胞（CTCs）扩展至细胞外囊泡（EVs）、循环RNA（circulating RNAs）和肿瘤教育血小板（TEPs），同时将读出来从突变拓展至甲基化、片段组学、转录组学、蛋白质组学以及多组学整合。本综述追溯了该领域从技术基础到当前应用的发展历程，涵盖早期检测与多癌种早期检测（MCED）、治疗选择与耐药监测、微小残留病灶（MRD）、复发风险分层以及主要癌症和特定非肿瘤疾病中的纵向疗效评估。研究人员区分了临床已确立的应用与新兴及探索性策略，并强调高分析性能本身并不等同于临床实用性。此外，研究人员进一步讨论了分析前处理、标准化、生物学混杂因素以及实施所需的证据。未来的进展将取决于以应用场景为导向的开发、前瞻性效用研究、纵向与多模态解读以及与既定诊断路径的整合。这些优先事项共同定义了从分子可检测性向可重复、可操作且具有临床意义的液体活检的转型。
1 引言
液体活检在过去二十年经历了关键转型，从概念性想法发展为临床工具。它将肿瘤相关信息从“局部组织快照”扩展为“全身性动态窗口”，实现了连续、微创且可重复的分子测量。该领域的早期快速扩张得益于关键分析物的发现——尤其是循环肿瘤DNA（ctDNA）和循环肿瘤细胞（CTCs）——以及检测技术的指数级进步。近年来，其他生物载体——包括外泌体/细胞外囊泡（EVs）、循环RNA和肿瘤教育血小板（TEPs）——逐渐成为焦点，进一步将液体活检从“突变读出”转向多维度的“肿瘤生态系统读出”，整合了表观遗传谱、片段组学、转录组学和蛋白质组学信息。随着测序、数字PCR、错误抑制策略和计算生物信息学的成熟，液体活检已稳步从研究工具走向临床路径中的多个关键节点。
然而，液体活检的“现状”既充满活力又高度异质。不同分析物在其携带的信息类型、时空代表性以及技术脆弱性方面存在显著差异；即使针对同一临床问题，信号强度和噪声结构在不同癌症类型、疾病分期和治疗背景下也各不相同。因此，最紧迫的临床问题已从“我们能否检测到它？”转变为“我们检测到的信息是否足以改变决策？”在早期检测和多癌种早期检测（MCED）中，挑战在于在低肿瘤负荷和高背景噪声条件下联合优化敏感性和特异性，同时解决假阳性、过度诊断以及下游随访路径的不确定性。在治疗选择和耐药监测中，任务是将分子变化与治疗反应之间的因果关联建立为可操作的依据，同时避免因平台变异性和克隆性造血等混杂因素导致的误分类。在微小残留病灶（MRD）评估和复发预测中，检测阈值和采样时间点必须与临床有意义的终点对齐，以实现可验证、可报销和可扩展的策略。与此同时，“隐形的工程细节”——包括分析前变量、样本处理流程、质量控制和法规合规性——往往比新算法或新型生物标志物更直接地决定可重复性和可靠性。
展望未来，液体活检的核心轨迹不太可能是用一种分析物替代另一种，而是围绕特定临床任务进行互补性整合：针对具体问题选择最合适的信息载体和测量维度，并通过连贯的证据分级和标准化将研究信号转化为可实施的临床工作流程。基于这一视角，本综述遵循“过去—现在—未来”的叙事结构，对关键液体活检分析物和方法学的演变进行结构化综合；总结主要肿瘤类型和特定非肿瘤疾病中的临床证据、局限性和证据成熟度；并强调真实世界实施的实际决定因素，包括分析前和质量体系、监管考量以及转化路径。本文是一篇以临床为导向的叙述性综述，基于针对性文献检索，重点纳入里程碑式研究、临床验证研究、专业指南、监管文件以及近期高质量证据。我们的目标不是提供已报道生物标志物的详尽目录，而是区分临床已确立的应用与新兴方法，并阐明进一步转化所需的证据。
2 液体活检的历史演进与方法学进展
液体活检已从最初对循环核酸的观察，发展为一门由分子生物学、测序、微流控和计算错误抑制技术推动的可临床部署的学科。从概念上看，这一演进可被视为随时间叠加的一系列“生物学层次”：无细胞核酸（cfDNA/ctDNA）、完整细胞分析物（CTCs）以及囊泡和宿主反应信号（EVs、非编码RNA和TEPs）。这种分层扩展反映了该领域的核心主题：没有单一分析物是普遍最优的，每一类新的生物标志物都是为了解决先前方法的敏感性、特异性或生物学可解释性方面的局限性而出现的。
2.1 cfDNA/ctDNA：从发现到临床可操作的分子读出
2.1.1 演进概述
cfDNA于1948年由Mandel和Métais在人类血浆中首次发现，存在于健康个体和多种疾病患者中。这一开创性发现确立了循环核酸的存在，并为数十年来对其生物学起源和临床相关性的研究奠定了基础。1977年，Leon等人报告癌症患者血清中cfDNA浓度显著高于健康对照，将cfDNA丰度与恶性疾病状态联系起来。1994年，在胰腺癌患者的血浆cfDNA中检测到KRAS突变，提供了cfDNA部分来源于肿瘤细胞的直接证据，正式确立了ctDNA的概念。1997年，Lo及其同事在母体血浆中发现胎儿DNA序列，催化了无创产前检测（NIPT）的发展。在方法学层面，大规模并行测序的引入加速了NIPT的采用，同时使癌症中日益灵敏的ctDNA分析成为可能。到2014年，ctDNA检测已在结直肠癌（CRC）中完成KRAS/BRAF检测的临床验证，标志着从概念验证向临床转化的过渡。随后几年，研究重心从以突变为中心的检测转向表观遗传和全基因组方法，包括基于甲基化的MCED平台和多分析物策略。同时，cfDNA全基因组测序策略已在肝细胞癌（HCC）的多中心早期检测项目中进行评估。
2.1.2 基本内涵与临床相关性
cfDNA指循环在血浆中的细胞外DNA片段。在健康个体中，cfDNA主要来源于生理性细胞更新和主动释放过程。cfDNA片段通常约160个核苷酸长，符合核小体包装特征。其在循环中的存留时间短（5-150分钟），受组蛋白复合物、脂质或囊泡结合的保护影响。这种快速周转是cfDNA用于动态监测的基础，但也对分析前和分析过程提出了严格要求。ctDNA是cfDNA中源自肿瘤的部分，反映肿瘤特异性的基因组和表观基因组改变。其丰度取决于肿瘤负荷、位置、血管分布、转移状态和分期，导致高度可变的占比。尽管大多数ctDNA检测使用血浆，但肿瘤来源的DNA也可从腹水、胸腔积液、尿液和脑脊液（CSF）中获得，其中CSF对中枢神经系统恶性肿瘤尤为有价值。ctDNA的半衰期短，可实现肿瘤动力学的实时追踪。除体细胞突变外，ctDNA还携带甲基化、微卫星不稳定性（MSI）等信息。一个关键的定量指标是变异等位基因频率（VAF），定义为在某一基因组位点上携带特定突变的cfDNA分子的比例。准确检测和定量低VAF突变仍是主要技术瓶颈。在分析层面，当前的ctDNA技术通常依赖于扩增方法和/或靶向测序。qPCR可实现实时扩增监测和多重检测，数字PCR则提供稳健的罕见变异检测和精确的绝对定量。下一代测序（NGS）支持更广泛的基因组覆盖范围。ARMS提供快速、经济有效的单点突变筛查。cfDNA和ctDNA通过实现微创、实时的肿瘤基因组和表观基因组改变检测，奠定了液体活检的分子基础。然而，它们无细胞、片段化和群体平均的特性——以及对肿瘤脱落的强烈依赖性——从根本上限制了其敏感性和生物学可解释性，尤其是在早期疾病中。这些内在局限性推动了向细胞分析物（最显著的是CTCs）的概念转变。
2.2 CTCs：为液体活检增添细胞维度
2.2.1 演进概述
CTCs的概念可追溯至1869年，当时Ashworth在一名转移性癌症患者的血液中观察到肿瘤细胞。然而，由于CTCs极为罕见以及富集和检测的技术难度，进展在一个多世纪内一直缓慢。1998年，Racila等人报告从血液中分离出CTCs并显示其与病理分期的相关性，标志着现代复兴。后续研究确立了CTC计数作为预后生物标志物的价值，特别是在转移性乳腺癌（BC）中。重要的是，标准化和临床认可逐步推进，美国癌症联合委员会（AJCC）的建议涉及BC中CTC检测的预后评估，中国国家指南也将其纳入。尽管临床兴趣不断扩大，标准化的临床CTC计数仍集中于CellSearch等平台，这既体现了该领域的成熟度，也反映了持续的瓶颈。
2.2.2 基本内涵与临床相关性
CTCs是从原发灶或转移灶脱落并进入外周血的肿瘤细胞。它们在循环中通常仅存活1-2.5小时，但一部分可逃避凋亡/吞噬作用，经历上皮-间充质转化（EMT），并参与远处转移。CTCs作为细胞分析物具有独特价值：它们含有完整的DNA、RNA和蛋白质，并保留了空间和表型信息。作为活性实体，CTCs能更直接地捕获动态肿瘤生物学和异质性，支持早期诊断、转移风险预测、复发监测和治疗反应评估等应用。在生物学和技术层面，两个主要障碍限制了更广泛的临床转化：极端稀有性和高度异质性。
2.2.3 富集与检测
CTC富集方法大致分为免疫富集和物理富集，共同目标是减少背景血细胞以便于下游分析。免疫富集包括免疫磁珠捕获和微流体免疫吸附芯片。CellSearch是一种代表性的免疫磁性正选平台。负选富集则以标记非依赖的方式去除白细胞以富集CTCs。微流体免疫吸附提供快速处理和可调的流动模式以增强抗体-细胞相互作用。物理富集利用CTCs与血细胞之间的内在差异。基于过滤的装置和尺寸选择性材料被广泛探索，但捕获效率和细胞完整性之间存在权衡。CTC检测旨在确认存在/丰度并表征分子亚型。常用方法包括免疫荧光标记、RNA原位杂交、基于qPCR的检测和流式细胞术。新兴方法如成像分析、突变分析和单细胞测序进一步提高了生物学分辨率。CTCs将液体活检从分子片段扩展到完整细胞，但其稀有性和技术要求限制了可扩展性——尤其是在早期检测中。这一差距激发了人们对丰富、稳定的循环信号（如ncRNAs和EVs）的兴趣。
2.3 ncRNAs：从“转录噪声”到循环调控生物标志物
2.3.1 演进概述
证明稳定循环的miRNAs及其区分癌症患者与对照组能力的研究，帮助确立了ncRNAs作为候选液体活检生物标志物的地位。全基因组表征随后确定环状RNA（circRNAs）丰富且保守，扩大了对这类RNA的兴趣。命名法和数据库资源的标准化进一步加速了该领域的发展。
2.3.2 基本内涵与临床相关性
ncRNAs构成循环细胞游离RNA（cfRNA）的主要成分。循环ncRNAs可通过主动分泌或在细胞死亡时释放，并在调节染色质状态、转录和细胞命运程序中发挥核心作用。它们在血液中的稳定性、组织相关的表达模式以及区分恶性和癌前状态的潜力，支持其作为液体活检生物标志物的价值。miRNAs通过RISC复合物调节基因表达。大量循环miRNAs与Argonaute2复合物结合，独立于囊泡，从而保护这些RNA免受胞外降解。许多miRNAs表现出癌症相关的差异表达，支持其在诊断、监测和预后中的应用。在方法学上，miRNA检测包括基于测序的方法、基于扩增的方法和基于杂交的方法。长链ncRNAs参与转录调控和染色质重塑，并在多种癌症中显示出循环生物标志物潜力。circRNAs和snoRNAs进一步扩展了ncRNA生物标志物图谱。尽管循环ncRNAs能够捕获动态调控状态，但其细胞外稳定性、细胞来源以及对分析前变异性的易感性仍未完全解决。这些局限性催生了人们对EVs日益增长的兴趣。
2.4 EVs：受保护的货物与细胞间通讯
2.4.1 演进概述
EVs最早于1983年被观察到，后来被称为“外泌体/EVs”，但最初被视为细胞废物。2007年Valadi等人的一项重要转折性研究表明，EVs携带功能性mRNA和miRNA，揭示了细胞间遗传通讯的机制，重新激发了该领域的活力。
2.4.2 基本内涵与临床相关性
EVs是由活细胞释放的纳米级磷脂双层囊泡，富含多种货物。它们存在于多种生物体液中。肿瘤细胞可释放大量EVs，这些囊泡参与肿瘤发生和进展，并为生物标志物检测提供受保护的隔室。EV货物可以增强核酸稳定性，并实现对肿瘤生物学的互补性分析。然而，临床转化受到EV丰度变异性、分离硬件、纯化质量以及从复杂体液中分离低丰度囊泡的难度等因素的限制。当前EV分离方法包括密度梯度分离、聚合物沉淀、基于尺寸的方法、亲和捕获、电动力学分离、尺寸排阻色谱、超速离心和微流控。每种方法都有其权衡。鉴于单一方法的局限性，通常需要集成的工作流程。EV表征通常依赖于囊泡示踪、透射电子显微镜和粒径测定。下游货物分析通常采用免疫印迹、ELISA和流式细胞术进行蛋白质分析，以及qRT-PCR、dPCR、NGS等方法进行RNA分析。新兴的生物传感器平台进一步提高了分析灵敏度。EVs提供受保护的、信息丰富的货物，通过将核酸信号与其细胞环境相结合，桥接了分子和细胞液体活检范式。然而，囊泡群体的显著异质性、缺乏标准化的分离和表征方案，以及临床验证的可扩展检测的稀缺，目前阻碍了大规模实施。
2.5 TEPs：高可及性的宿主反应信号
TEPs，也称为肿瘤条件化血小板，是指其RNA和蛋白质组成被肿瘤衍生分子动态改变的血小板。通过直接和间接相互作用，癌细胞可诱导肿瘤细胞诱导的血小板聚集，促进血管生成和转移，并与不良临床结局相关。尽管无核且寿命短，TEPs积极参与多种癌症特征，包括免疫逃逸和肿瘤微环境重塑。TEPs已在广泛的实体瘤中显示出诊断和预后潜力。标志性RNA测序研究在区分癌症患者与健康个体方面取得了高准确性，并提供了肿瘤类型定位信号。在非小细胞肺癌（NSCLC）中，基于TEP的检测显示出分期依赖的性能，血小板ITGA2B表达与预后和肺结节分层相关。与CTCs和ctDNA相比，TEPs相对易于获取和分离，支持可扩展的检测开发。TEP分析通常使用RNA测序来鉴定血小板转录组特征，并使用靶向RT-PCR验证选定的RNA标志物。然而，目前限制临床转化的若干挑战包括对肿瘤-血小板相互作用机制理解的不完全、血小板转录组和蛋白质组数据整合有限，以及需要更大规模、肿瘤类型特异性的验证队列。TEPs捕捉全身性肿瘤-宿主串扰，并提供具有良好诊断和肿瘤定位能力的、高度可及的RNA生物标志物。然而，未解决的生物学机制和不足的多组学整合继续阻碍临床标准化。
2.6 分析前标准化：从分析潜力到临床可靠性
分析前标准化对于将液体活检从研究转化为常规临床实践至关重要，因为不一致的样本处理可能产生人为信号并损害可重复性。由于液体活检分析物在稳定性和对处理的敏感性方面存在差异，因此统一的采集、稳定化、离心、储存和记录程序不可或缺。外周血是最常见的cfDNA来源，但在特定情况下，唾液、腹水和尿液也可能提供信息。血浆通常优于血清，因为白细胞裂解导致基因组DNA污染的风险较低。对于CTCs，CTC释放的昼夜节律变化促使了标准化采样建议。管材选择至关重要，因为cfDNA半衰期短。EDTA管需要及时处理以防止白细胞裂解和gDNA污染；稳定化cfDNA管可延长允许的处理窗口。离心工作流程和低温控制可减少细胞残留和降解，长期储存通常在-80°C。监管和质量框架、外部质量评估计划以及全球联盟在开发参考物质、基准测试性能和制定最佳实践指南方面发挥了重要作用。剩余的挑战包括对不同分析物处理延迟的共识，以及针对新兴生物标志物（如EV衍生的DNA/RNA）的进一步标准化。在分析层面，分析前标准化是将液体活检从高潜力的研究工具转化为临床可靠的诊断方式的关键促成因素。协调一致的样本采集、处理和质量控制方案对于可重复性、监管批准和跨平台可比性是不可或缺的。总体而言，液体活检的历史演进反映了生物信息的逐步分层——从片段化核酸到完整细胞、囊泡货物和宿主反应信号。每一类分析物都解决了特定的生物学和技术局限性，强调了临床实用性并非源于单一生物标志物，而是源于对互补液体活检模式的背景依赖性整合。
3 肿瘤学应用：临床应用案例与证据成熟度
液体活检已从分析创新转变为癌症护理中临床可操作的手段。然而，其临床实用性本质上是背景依赖的，受肿瘤生物学、解剖约束、分期特异性肿瘤负荷以及所解决的特定临床问题的影响。不同的液体活检分析物——包括ctDNA、CTCs、EVs、ncRNAs和宿主反应信号——在不同癌症类型中表现出独特的优势和局限性。在癌症护理中，液体活检在早期检测、靶向治疗选择的分子分析、MRD评估、治疗反应监测和耐药追踪方面已显示出特别的价值。重要的是，没有单一分析物是普遍最优的。相反，有效的临床部署依赖于将特定分析物与适当的临床应用场景和肿瘤背景对齐。在本节中，我们提供基于系统的液体活检在主要癌症背景下的应用概述，强调不同分析物如何满足不同的未满足临床需求。为了区分临床已确立的应用与新兴方法，代表性的液体活检用例在整个章节中被分为四个证据成熟度层级：第1层为临床已确立，包括在特定临床环境中获得监管批准和/或专业指南认可的应用；第2层为后期临床转化，由大量前瞻性、多中心或其他高级临床验证证据支持但尚未常规实施；第3层为早期临床验证，涵盖在临床队列中评估但仍需更广泛的前瞻性或外部验证的应用；第4层为发现与机制探索，包括早期探索性人体研究和主要为机制性或临床前证据。
3.1 肺癌
3.1.1 疾病背景与未满足的临床需求
肺癌仍是全球最常见的恶性肿瘤之一，死亡率高。它大致分为小细胞肺癌和NSCLC，后者约占病例的85%，包括LUAD和鳞状细胞癌（LUSC）。瘤内和瘤间异质性使NSCLC的诊断和治疗变得困难。约60%的患者在临床诊断时已出现远处转移，导致总生存期（OS）较差。尽管早期检测和干预能显著改善预后，但肺癌具有漫长的无症状期。传统诊断方式存在固有局限性。液体活检现已支持晚期NSCLC的分子分析和纵向监测，并正在积极评估用于早期检测和筛查。
3.1.2 早期检测与筛查
ctDNA已被广泛评估用于早期肺癌检测。血浆ctDNA水平在肺癌患者中显著高于良性炎性肺病患者，提示其在区分恶性和非恶性呼吸系统疾病方面的潜在价值。基于血浆DNA的方法在肺癌中显示出诊断潜力，尽管敏感性仍高度依赖于疾病分期、肿瘤脱落和检测设计。ctDNA的诊断和预后价值基于对肿瘤特异性分子改变的检测。然而，在早期NSCLC中，解释ctDNA突变需谨慎，因为低频变异可能源自非肿瘤性克隆性造血。
3.1.3 分子分析与治疗选择
除早期检测外，ctDNA分析在晚期和转移性肺癌的管理中处于核心地位。在此背景下，液体活检支持治疗选择的分子分析、预后判断以及反应和耐药的动态监测。其中最为成熟的应用之一是ctDNA中EGFR突变的检测。血液ctDNA检测可靠地识别EGFR突变状态，并与肿瘤组织基因分型显示出强一致性。
3.1.4 MRD评估与复发预测
系列ctDNA分析已成为早期NSCLC术后MRD监测和复发预测的有力工具。治愈性手术后检测到ctDNA可识别出影像学复发风险显著升高的患者。标志性研究为ctDNA MRD在NSCLC中的预后价值提供了有力证据。在TRACERx研究中，标志性MRD分析的复发阳性预测值（PPV）达93%。在NADIM II试验中，MRD阳性与事件无进展生存期和OS的风险比为10.2。
3.1.5 治疗反应与耐药监测
系列ctDNA分析进一步实现了治疗反应的实时评估和获得性耐药的早期识别。在靶向治疗背景下，新兴的耐药相关突变可在影像学进展之前被检测到。血浆ctDNA检测在晚期NSCLC中的临床实施体现在指南支持的分子检测中。
3.1.6 预后分层
除治疗选择外，ctDNA和CTCs在肺癌中提供互补的预后信息。在晚期NSCLC中，ctDNA检测到的EGFR突变与较短的OS相关。CTCs在肺癌进展的所有阶段均可检测到，但由于其在早期肿瘤发展过程中在外周血中极为罕见，可靠的CTC检测在晚期疾病中更为可行。在早期肺癌中，CTC的低丰度历史上限制了其诊断敏感性。最近的进展部分克服了这些挑战。除了计数外，CTCs的分子分析扩展了其诊断和生物学相关性。重要的是，CTCs在非肿瘤携带者血液中极为罕见，赋予了高分析特异性。
3.1.7 新兴生物标志物与多分析物整合
3.1.7.1 非编码RNA
循环ncRNAs已成为肺癌液体活检中有用的标志物。在miRNAs中，let-7a是研究最广泛的生物标志物之一。miR-125也显示出诊断价值。除单个标志物外，多miRNA签名提供增强的预后分辨率。LncRNAs和circRNAs进一步扩展了肺癌液体活检的调控景观。
3.1.7.2 细胞外囊泡
EVs通过保护和运输肿瘤来源的RNA和蛋白质货物，提供了额外层次的生物学信息。肺癌来源的外泌体有助于形成免疫抑制性微环境和肿瘤增殖。多分析物外泌体RNA签名进一步增强诊断性能。除了诊断作用外，EVs还积极参与治疗耐药。
3.1.7.3 肿瘤教育血小板
TEPs最近作为可及且生物学响应的肺癌液体活检分析物受到关注。对早期NSCLC患者血小板样本的RNA测序显示，ITGA2B表达显著升高。TEP衍生的ITGA2B在临床队列中显示出诊断和预后关联。
3.1.8 证据成熟度与转化状态
肺癌中的液体活检应用跨越四个证据成熟度水平。第1层集中在晚期或转移性NSCLC中血浆ctDNA靶向检测和全面基因组分析。第2层包括术后ctDNA MRD评估和cfDNA片段组学用于早期检测或肺结节风险评估。第3层包括cfDNA甲基化分类器、TEP RNA签名、CTC/CTEC检测和外泌体miRNA谱。第4层包括EV相关的ncRNA和circRNA通路。
3.2 肝细胞癌
3.2.1 疾病背景与未满足的临床需求
HCC是最常见的原发性肝癌，也是全球癌症相关死亡的主要原因之一。HCC通常发生在慢性肝损伤和肝硬化背景下。尽管HCC管理取得了重大进展，但主要的临床挑战依然存在。两个未满足的临床需求主导着HCC管理：在高危人群中改善早期检测，以及通过改进治疗反应和耐药的预测来细化分期特异性治疗策略。
3.2.2 早期检测与筛查
ctDNA已成为早期HCC检测的生物标志物。HCC患者血浆ctDNA水平和肿瘤相关分子改变高于良性慢性肝病个体。一项系统综述报告ctDNA的汇总敏感性为0.83，特异性为0.90。值得注意的是，针对关键驱动改变（如TERT启动子和TP53突变）的ctDNA在I期HCC患者血浆样本中可检出率超过75%。多项甲基化检测显示出稳健的早期检测性能。然而，在早期HCC中解释ctDNA信号需谨慎。
3.2.3 分子分析与治疗选择
在晚期或转移性HCC中，靶向ctDNA分析已显示出分子表征、预后分层以及治疗反应或耐药评估的可行性。
3.2.4 MRD评估与复发预测
术后ctDNA MRD评估在HCC的早期前瞻性研究中显示出预后价值。
