基于网络药理学与实验研究探讨甘草酸对脂多糖诱导胰腺细胞损伤中细胞活力、凋亡、炎症反应及铁死亡的影响

《Letters in Drug Design & Discovery》：Network pharmacology and experimental studies to investigate the effects of glycyrrhizic acid on cell viability, apoptosis, inflammatory response, and ferroptosis in LPS-induced pancreatic cellular injury

　　

**目的**：胰腺炎是一种常见的消化系统疾病，具有高发病率和高死亡率，然而有效的药物干预仍然有限。甘草酸（glycyrrhizic acid, GA）是一种源自甘草的天然化合物，具有公认的解毒和抗炎特性，已在多种炎症性疾病中显示出治疗潜力；然而，其对胰腺细胞的保护作用及其潜在机制仍知之甚少。本研究旨在利用网络药理学和细胞实验，探讨GA对脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）诱导的人胰腺导管上皮细胞（HPDE6-C7）损伤的影响。
**方法**：研究人员使用Swiss Target Prediction、GeneCards和String数据库建立药物-疾病靶点网络，并使用Cytoscape筛选靶点。使用DAVID数据库进行京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）富集分析，以阐明潜在的生物学机制。研究人员用LPS诱导HPDE6-C7细胞，并用不同浓度的GA（20、40、60 μM）处理。通过细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8, CCK-8）检测细胞活力，通过流式细胞术检测细胞凋亡，通过酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）检测炎性细胞因子水平。研究人员使用商业试剂盒测量活性氧（reactive oxygen species, ROS）、丙二醛（malondialdehyde, MDA）、谷胱甘肽（glutathione, GSH）和铁离子水平来评估氧化应激和铁死亡。通过蛋白质印迹法（Western blot）检测溶质载体家族7成员11（solute carrier family 7 member 11, SLC7A11）和谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4, GPX4）的蛋白水平。
**结果**：网络药理学分析确定了参与磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（phosphoinositide 3-kinase-protein kinase B, PI3K-AKT）、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）和核因子κB（nuclear factor kappa-B, NF-κB）信号通路的17个关键靶基因。细胞实验表明，高剂量GA（60 μM）显著提高了LPS诱导的HPDE6-C7细胞的活力，减少了细胞凋亡和炎症，降低了ROS、MDA和Fe²⁺水平，并增加了GSH水平（P < 0.05）。同时，60 μM GA恢复了LPS诱导的HPDE6-C7细胞中SLC7A11和GPX4蛋白水平的下降（P < 0.05）。
**结论**：高剂量GA可减轻LPS诱导的HPDE6-C7细胞损伤，包括活力受损、凋亡、炎症反应、氧化应激和铁死亡。这些发现表明，GA在胰腺炎模型（包括高脂血症状态）中具有进一步研究的潜力。

胰腺炎是消化系统常见的炎症性疾病，具有高发病率和高死亡率。其病理机制复杂，涉及胰酶过早激活、氧化应激及炎症因子过度释放。早期死亡主要由局部损伤触发的炎症激活“级联”所致，可发展为全身炎症反应综合征和多器官功能障碍。近年来，铁死亡（ferroptosis）——一种由脂质过氧化和谷胱甘肽耗竭驱动的铁依赖性程序性细胞死亡——被认为在胰腺细胞损伤中起关键作用。铁死亡关键调控因子溶质载体家族7成员11（solute carrier family 7 member 11, SLC7A11）和谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4, GPX4）在氧化应激下显著受损，加剧细胞损伤。然而，针对炎症和铁死亡的有效药物干预仍然有限。

甘草酸（glycyrrhizic acid, GA）是甘草根中的主要活性三萜皂苷，具有强效抗炎、抗氧化和细胞保护作用。GA可抑制高迁移率族蛋白B1（high-mobility group box 1, HMGB1）释放和核因子κB（nuclear factor kappa-B, NF-κB）活化，调节磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（phosphoinositide 3-kinase-protein kinase B, PI3K-AKT）和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）信号通路，并可通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin, mTOR）信号调控铁死亡。尽管GA在多种炎症和氧化应激相关疾病中显示治疗潜力，但其在胰腺炎中的保护作用尚未充分研究。因此，研究人员将网络药理学与体外实验相结合，系统探讨GA对脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）诱导的人胰腺导管上皮细胞（HPDE6-C7）损伤的保护作用及机制。

研究人员从上海静远生物科技有限公司获得HPDE6-C7细胞系。主要技术方法包括：采用Swiss Target Prediction、GeneCards和String数据库预测GA靶点与胰腺炎疾病靶点，通过Cytoscape构建蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI）网络，利用DAVID数据库进行KEGG通路富集分析。体外实验中，以10 μg/mL LPS诱导HPDE6-C7细胞，并用20、40、60 μM GA处理。通过CCK-8法检测细胞活力，流式细胞术检测凋亡，酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）检测肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）、白细胞介素-6（interleukin-6, IL-6）和白细胞介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）水平，商品化试剂盒检测活性氧（reactive oxygen species, ROS）、丙二醛（malondialdehyde, MDA）、谷胱甘肽（glutathione, GSH）和Fe²⁺水平，Western blot检测SLC7A11和GPX4蛋白表达。统计分析采用单因素方差分析和Tukey HSD事后检验，每组3个生物学重复。

**3.1 网络药理学分析GA治疗胰腺炎的靶点**
利用Swiss Target Prediction筛选出GA的100个潜在靶点，GeneCards数据库获得22620个胰腺炎相关靶基因，二者的交集为89个共同靶基因。将89个靶基因导入String数据库构建PPI网络，Cytoscape的CytoNCA插件分析显示，信号转导与转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3, STAT3）、原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src（SRC）和胱天蛋白酶3（caspase 3, CASP3）为核心靶点。DAVID数据库KEGG富集分析显示，89个靶基因中有76个富集于90条信号通路，其中与炎症、氧化应激和铁死亡相关的通路包括PI3K-AKT、MAPK和NF-κB信号通路。基于节点相互作用和KEGG分析，筛选出17个与炎症、氧化应激和铁死亡相关的关键靶基因。

**3.2 GA对LPS诱导HPDE6-C7细胞活力和凋亡的影响**
CCK-8和流式细胞术检测显示，LPS暴露显著降低HPDE6-C7细胞活力并增加凋亡，而GA处理呈剂量依赖性逆转这些效应，其中高剂量（60 μM）保护作用最显著（P < 0.05）。

**3.3 GA对LPS诱导HPDE6-C7细胞炎症水平的影响**
ELISA结果显示，GA呈剂量依赖性显著降低LPS诱导的TNF-α、IL-6和IL-1β升高（P < 0.01），表明GA有效减轻LPS损伤细胞的炎症反应。

**3.4 GA对LPS诱导HPDE6-C7细胞氧化应激和铁死亡的影响**
研究人员检测了ROS、MDA、GSH和Fe²⁺水平。LPS显著升高ROS、MDA和Fe²⁺水平并降低GSH水平，GA处理呈剂量依赖性改善这些改变。Western blot显示，60 μM GA恢复了LPS抑制的铁死亡标志物SLC7A11和GPX4蛋白表达（P < 0.05）。

讨论部分指出，网络药理学预测与实验结果相互印证。GA通过多靶点、多通路发挥抗炎和抗铁死亡作用。LPS诱导的炎症模型中，NF-κB活化是促炎细胞因子转录上调的关键事件，GA显著降低TNF-α、IL-6和IL-1β水平；MAPK通路也是炎症介质产生的重要调节环节。铁死亡方面，GA通过恢复SLC7A11和GPX4表达、降低ROS和Fe²⁺水平、增加GSH含量，抑制铁死亡。研究还讨论了自噬与铁死亡的可能联系及胰腺微环境的神经内分泌调节，但强调需进一步机制研究。局限性包括：网络药理学预测依赖数据库注释；体外单细胞模型不能完全模拟临床胰腺炎的多细胞相互作用和代谢紊乱；样本量较小；仅使用单一细胞系；未设置阳性对照组。未来需在脂质过载模型和高脂饮食动物模型中进一步验证。

研究结论：高剂量GA可减轻LPS诱导的HPDE6-C7细胞损伤，包括细胞活力受损、凋亡、炎症反应、氧化应激和铁死亡。这些发现表明GA在胰腺炎模型（包括高脂血症状态）中具有进一步研究的潜力。GA作为已在临床使用的天然化合物，其多靶点调控能力可能为胰腺炎提供新的治疗策略。