基于LC-MS与分子网络的Streptomyces fimicarius-ghR抗马铃薯普通疮痂病病原菌活性代谢物注释

《Chemistry & Biodiversity》：LC-MS-Based Annotation of Bioactive Metabolites From Streptomyces fimicarius-ghR Against the Common Scab Pathogen Using Molecular Networking

　　

天然产物（natural products）长期以来是抗菌药物（antimicrobial drugs）发现的重要基础。链霉菌属（Streptomyces）成员因能产生结构多样的代谢物、占据多样生态位并提高农业系统土壤养分有效性而尤受关注。该类菌也是对植物病原菌具有强拮抗活性的抗生素的重要资源库。在一项持续研究中，S. fimicarius-ghR表现出抗菌活性，尤其对马铃薯普通疮痂病病原菌（Streptomyces sp.）具有活性。为阐明其生物防治功效的化学基础，研究人员采用基于计算代谢组学的生物勘探策略，表征拮抗菌发酵液中潜在抗疮痂病代谢物的化学多样性。S. fimicarius-ghR的乙酸乙酯（EtOAc）提取物对Streptomyces sp. FG1具有抑制活性，最低抑菌浓度（MIC）为0.3 mg/mL。该EtOAc提取物经液相色谱-四极杆飞行时间电喷雾串联质谱（LC-QTOF-ESI-MS/MS）分析，随后进行基于分子网络（MN）的数据分析。该方法注释出13个代谢物，包括多个分枝枯草菌素（mycosubtilins）异构体以及线性和环状表面活性素（surfactins）。这些发现提示，由S. fimicarius-ghR产生的脂肽类抗生素（lipopeptide antibiotics），尤其是表面活性素和分枝枯草菌素，可能在抑制马铃薯普通疮痂病病原菌中发挥核心作用。

马铃薯普通疮痂病（common scab）由致病链霉菌（Streptomyces）引起，主要造成块茎表面坏死性病斑，形态可为浅表、隆起或深凹木栓化，降低作物品质和商品性。有益非致病链霉菌是医用抗生素和农业生物防治的重要来源；其天然产物可用于防治植物病原菌、预防虫害、促进植物生长和缓解环境胁迫，化学类型包括萜类、环状和线性肽、大环内酯、多芳烃、糖苷和线性聚酮等。丰原素（fengycins）、表面活性素（surfactins）和伊枯草菌素（iturins）家族脂肽类抗生素（lipopeptide antibiotics，肽链与脂肪酸链相连的抗生素）在Bacillus属中具有重要生物活性，近年也在Streptomyces spp.中报道。尽管已有研究评估有益Streptomyces spp.减轻马铃薯普通疮痂病，但仅有一项研究对有益Streptomyces A1RT产生的isatropolone C进行化学表征。研究人员前期发现S. fimicarius-ghR处理病原侵染土壤可减轻萝卜和马铃薯疮痂病病斑，且具拮抗活性，但其有效抗菌成分尚未表征，因此开展本研究以评估其抗菌活性并注释活性抗菌化合物。

研究人员以S. fimicarius-ghR为对象，结合抗菌活性测定与基于GNPS平台的分子网络（molecular networking, MN；基于MS/MS谱相似性构建代谢物网络以辅助注释）分析。结果显示，其EtOAc提取物对Streptomyces sp. FG1的MIC为0.3 mg/mL，并经LC-QTOF-ESI-MS/MS注释出13个代谢物，包括多个mycosubtilins异构体及线性和环状surfactins。研究提示脂肽类抗生素可能是其抑制马铃薯普通疮痂病病原菌的核心物质，为生物制剂开发提供候选菌株和化学基础。

关键技术方法概括：研究人员采用来自伊朗Razavi-Khorasan省马铃薯根际的Streptomyces分离株ghR，经16S rRNA和rpoB基因测序鉴定为S. fimicarius，保存于FUM。技术流程包括发酵液EtOAc萃取、硅胶柱层析获得25个组分、纸片扩散法和肉汤微量稀释法测定对Streptomyces sp. FG1的MIC、LC-QTOF-ESI-MS/MS正负离子模式代谢组分析，以及GNPS分子网络、MZmine 3.2.0、Cytoscape 3.10.2、NAP、MS2LDA和Dereplicator+注释。

2.1 非致病链霉菌菌株特性：形态观察和酶活性定性试验显示，S. fimicarius-ghR在YME琼脂28°C培养7天后覆盖培养皿，气生和基质菌丝均白色，不产扩散色素，孢子链直；产淀粉酶、纤维素酶和蛋白酶，无几丁质酶活性，提示其细胞壁降解酶可能参与拮抗互作。

2.2 抗菌活性：研究人员前期温室试验中S. fimicarius-ghR对马铃薯普通疮痂病防效为88.88%±6.41%，并具产铁载体、产IAA、溶磷和促马铃薯生长等促生性状。平板和双培养试验显示其EtOAc提取物对细菌和真菌均有抑制，且抗菌活性强于抗真菌活性；对致病Streptomyces spp.抑菌圈18.7–33.8 mm，真菌中A. solani As6最敏感，生长抑制33.4%。

2.3 S. fimicarius-ghR对致病链霉菌的抗菌活性：纸片扩散法显示EtOAc提取物周围形成清晰抑菌圈；肉汤微量稀释法测得对Streptomyces sp.-FG1的MIC为0.3 mg/mL。25个柱层析组分中，F1、F2、F14、F16和F17显示明确抗菌活性，其余未检出抗菌活性。

2.4 LC-ESI-QToF-MS/MS分析与MN：LC-MSⁿ、MN和GNPS注释表明，EtOAc提取物主要成分包括脂肽；在感兴趣组分中检测到surfactin和iturin家族代谢物。据研究人员所知，这是首次在非致病S. fimicarius中报道surfactins和iturins的存在。

2.4.1 Mycosubtilins：iturin家族成员为环七肽，mycosubtilins由环七肽与C₁₄–C₁₇ β-氨基脂肪酸链相连，肽序列通常为Asn–Tyr–Asn–Gln–Pro–Ser–Asn，特定位置有D-氨基酸，脂肪酸链长度和分支差异形成异构体；其真菌杀伤性与膜孔形成、膜电导增强和细胞稳态破坏有关。第二大连通网络含m/z 1043、1057、1071和1085的离子，对应峰1–4，彼此质量差+14 Da（?CH₂?）；根据保留时间、MS1、MS/MS和GNPS库匹配，注释为mycosubtilins C₁₄–C₁₇。

2.4.2 Surfactins：surfactins是主要见于Bacillus的环状脂肽，对植物病原细菌如Ralstonia solanacearum和Streptomyces scabies有抑制作用，并影响swarming运动、生物膜形成和植物促生；其抗病原功能与膜孔形成、膜通透性改变和胞内物泄漏有关。结构多样性来自肽序列和脂肪酸链长度（C₁₂–C₁₈）变化，并可有环状或线性异构体。EtOAc提取物最大分子网络含正离子模式下[M+H]⁺ m/z 1008、1022、1036、1040、1054、1058、1081、1095和1109，与surfactins相关。

2.4.3 Cyclic Surfactins：保留时间73.3 min的化合物10给出m/z 1036 [M+H]⁺，MS²主要子离子m/z 685、441和227分别归属A₁+H₂O、A₃和A₅+H₂O；m/z 685来自环打开及β-羟基脂肪酸与谷氨酸残基间裂解。与文献比较，该化合物可能为C₁₅脂肪酸链surfactin。m/z 1008、1022和1050与化合物10有相似裂解途径和共同离子m/z 685、441、227，提示脂肪酸链不同，按保留时间、MS1、MS/MS和GNPS匹配可能为C₁₃、C₁₄和C₁₆链surfactins。文献报道三类surfactin异构体序列为Glu¹-Leu/Ile²-Leu³-Leu/Ile⁴-Asp⁵-Leu⁶-Val⁷、Glu¹-Val²-Leu³-Leu/Ile⁴-Asp⁵-Leu⁶-Leu/Ile⁷和Glu¹-Leu/Ile²-Leu³-Val⁴-Asp⁵-Leu⁶-Leu/Ile⁷。

2.4.4 Linear Surfactins：化合物6分子离子m/z 1040 [M+H]⁺，MS²见m/z 685、554、441、328和227（与脂肪酸、谷氨酸及其他氨基酸残基丢失相关），并见m/z 572、459、356和245（与脂肪酸头部链丢失相关）及681、582和469（与尾端氨基酸丢失相关），提示为14碳脂肪酸链线性surfactin；化合物8 m/z 1054 [M+H]⁺裂解相似，注释为线性脂肽，脂肪酸侧链分别为14和15碳。讨论指出，文献已从4个土壤Streptomyces分离株鉴定surfactins B、C和D；Liu et al. (2022)发现S. bikiniensis HD-087通过surfactins、iturins和fengycins抑制Magnaporthe oryzae孢子萌发和附着胞形成；Streptomyces G222 EtOAc提取物经LC-MS/MS和MN注释出环状和线性lichenysins与surfactins。与这些报道一致，S. fimicarius-ghR EtOAc提取物主要成分为mycosubtilins和surfactins等脂肽。

讨论部分总结：本研究将抗菌活性导向的组分分析与LC-MS/MS-MN注释结合，显示S. fimicarius-ghR的活性提取物以脂肽类成分为主，并首次在非致病S. fimicarius中报道surfactins和iturins，支持其作为抗马铃薯普通疮痂病生物防治菌株的化学基础。研究结论部分译为：综上，从马铃薯根际分离的S. fimicarius-ghR被鉴定为有前景的脂肽类抗生素来源和抗马铃薯普通疮痂病（Streptomyces sp.）的潜在生物防治剂；LC-ESI-MS/MS分析实现13个代谢物的推测性注释，包括多个mycosubtilins异构体以及线性和环状surfactins。这些发现为进一步探索该菌株提供有希望的基础，尤其可能推动商业农业用生物制剂的开发；未来研究应聚焦田间防效评价以及阐明所注释脂肽在触发植物防御反应中的潜在作用；此外，需进一步植物化学和光谱分析以确认所提结构。