基于LC-HRMS代谢组学与多变量统计分析的Zanthoxylum nemorale代谢物谱及生物活性研究

《Chemistry & Biodiversity》：Metabolite Profile and Biological Activities of Zanthoxylum nemorale: A Metabolomic and Multivariate Statistical Analysis Study

　　

本研究采用正己烷、乙酸乙酯和甲醇制备Zanthoxylum nemorale叶和茎提取物，通过非靶向液相色谱-高分辨质谱（LC-HRMS）代谢组学、多变量统计分析、抗氧化和抗菌测定，研究了其代谢物谱与生物活性。共推定鉴定出112种代谢物，包括香豆素类、木脂素类、黄酮类、生物碱类、酚酸类、萜类及脂肪酸类。甲醇提取物表现出最强的抗氧化活性，茎和叶提取物的半数抑制浓度（IC₅₀）分别为53.12 ± 1.11和60.70 ± 0.28 μg·mL^?1，并对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）显示出最高的抗菌活性。化学计量学分析（主成分分析PCA、偏最小二乘判别分析PLS-DA和层次聚类）根据植物器官和溶剂极性清晰地区分了各提取物。总体而言，提取物对革兰氏阳性菌的效果优于对革兰氏阴性菌和真菌。这些发现突显了Z. nemorale作为抗氧化和抗菌植物化学物质潜在来源的价值，并证明了代谢组学在关联化学成分与生物活性方面的作用。

天然产物是发现治疗药物的重要来源，植物来源的次级代谢物如生物碱、黄酮、酚酸、萜类、香豆素和木脂素等具有广泛的药理活性。随着抗菌药物耐药性问题日益严峻，以及消费者对天然抗氧化剂和生物活性成分需求的增加，系统研究药用植物的药理潜力受到广泛关注。Zanthoxylum属（芸香科）多种物种在传统医学中用于治疗感染、炎症、胃肠道疾病和寄生虫病等，但分布于巴西的Zanthoxylum nemorale，其民族植物学应用、生态特征和植物化学组成信息十分有限。尽管对同属其他物种已有较多研究，但针对Z. nemorale的代谢物组成及其化学成分与生物活性之间关系的研究仍属空白。因此，本研究首次整合代谢组学和生物活性测定，系统探索该物种的化学多样性和药用潜力。

研究人员采用正己烷、乙酸乙酯和甲醇分别提取Z. nemorale的叶和茎，获得6种提取物，并利用非靶向液相色谱-高分辨质谱（LC-HRMS，一种结合液相色谱与高分辨质谱的分析技术）代谢组学、多变量统计分析、抗氧化和抗菌测定，分析了提取物的代谢物谱和生物活性。结果显示，甲醇提取物具有最强的抗氧化活性，其中茎甲醇提取物（ZNSTM）的IC₅₀为53.12 ± 1.11 μg·mL^?1，叶甲醇提取物（ZNLM）为60.70 ± 0.28 μg·mL^?1；这两种提取物分别对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）表现出杀菌活性。研究人员共推定注释了112种代谢物，包括香豆素类、木脂素类、黄酮类、生物碱类、酚酸类、萜类和脂肪酸类。多变量统计分析（主成分分析PCA、偏最小二乘判别分析PLS-DA和层次聚类）可根据植物器官和溶剂极性清晰区分不同提取物。这些发现表明，Z. nemorale是潜在的抗氧化和抗菌植物化学物质来源，同时证明了代谢组学在关联化学成分与生物活性方面的重要价值。

在技术方法方面，植物材料于2019年10月采集自巴西巴伊亚州Amargosa的Quilombola社区Três Lagoas，凭证标本（HURB 2064）存放于Bahia Rec?ncavo植物标本馆。叶和茎干燥粉碎后，依次用正己烷、乙酸乙酯和甲醇在室温下浸泡72小时，减压浓缩得到6种提取物。抗氧化活性采用二苯基苦基肼（DPPH）自由基清除法测定IC₅₀。抗菌活性采用肉汤微量稀释法测定最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌/杀真菌浓度（MBC/MFC），受试菌包括革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、藤黄微球菌）、革兰氏阴性菌（大肠杆菌、铜绿假单胞菌）和真菌（白色念珠菌、光滑念珠菌）。代谢组学分析采用高效液相色谱-高分辨质谱（HPLC-HRMS），在C₁₈柱上分离，正负电喷雾电离（ESI）模式采集数据；数据经XCMS Online处理后，通过精确质量、分子式、加合物信息和数据库（HMDB）比对进行代谢物注释，注释等级为代谢组学标准倡议（Metabolomics Standards Initiative, MSI）Level 2（推定注释）。多变量统计分析包括PLS-DA（采用留一交叉验证，R²=0.93，Q²=0.85）、变量重要性投影（VIP）分析和层次聚类分析。

在结果部分，（一）抗氧化活性：DPPH测定显示，各提取物IC₅₀范围在53.12至944.24 μg·mL^?1之间，其中甲醇提取物活性最强，叶乙酸乙酯提取物（ZNLEA）也表现出较强活性（IC₅₀=69.53 μg·mL^?1），而茎己烷提取物在测试浓度下无活性。这些结果表明，抗氧化活性主要与极性和中等极性代谢物有关，且受植物器官影响。（二）抗菌活性：提取物对革兰氏阳性菌的抑制活性显著优于革兰氏阴性菌和真菌。ZNSTM对金黄色葡萄球菌的MIC和MBC均为62.5 μg·mL^?1，ZNLM对蜡状芽孢杆菌的MIC和MBC亦为62.5 μg·mL^?1。ZNLEA是唯一对革兰氏阴性菌（大肠杆菌和铜绿假单胞菌）表现出弱抑制作用的提取物（MIC=500 μg·mL^?1）。真菌抑制仅见于ZNSTM对白色念珠菌和ZNLEA对光滑念珠菌。（三）代谢物鉴定与化学多样性：通过LC-HRMS分析，研究人员推定注释了112种代谢物，涵盖香豆素类、木脂素类、黄酮类、生物碱类、酚酸类、萜类和脂肪酸类等，其中木脂素、含氮代谢物和香豆素类在区分提取物中贡献较大。（四）多变量统计分析：PLS-DA模型可清晰区分6种提取物，甲醇提取物与己烷提取物在成分1上分离，乙酸乙酯提取物位于中间；层次聚类主要按植物器官分组，溶剂极性进一步影响聚类结构。VIP分析显示，5′,5″-didemethoxypinoresinol、3-羟基脱氢吴茱萸次碱（3-hydroxydehydroevodiamine）、8-羟基-9-甲氧基-2,3-(亚甲二氧基)苯并菲啶等代谢物是区分提取物的关键特征。

在讨论部分，研究人员指出，提取溶剂和植物器官共同决定了Z. nemorale提取物的化学与功能特征。极性/中等极性富含酚类的组分与较强的抗氧化活性相关，而抗菌活性则涉及更广泛的化学类别，包括脂溶性、含氮和香豆素类成分。VIP特征与生物活性之间的关联应视为相关性而非因果证据，需要进一步的结构确认和实验验证。研究结论部分可翻译为：本研究提供了Z. nemorale的整合代谢组学和生物学表征，表明提取溶剂和植物器官影响其化学成分和生物活性。LC-HRMS分析结合多变量分析揭示了不同提取物之间的独特代谢组学特征。甲醇提取物表现出最强的抗氧化活性，并对革兰氏阳性菌具有显著抗菌作用。推定注释的木脂素、含氮代谢物、香豆素类、黄酮类及脂溶性成分促进了提取物之间的化学区分。尽管其中一些代谢物类别可能与观察到的生物活性有关，但它们的单独贡献仍有待确定。结构确认、定量分析和生物活性导向分离对于验证所提议的关联并确定产生所观察效应的化合物至关重要。这些发现为进一步研究Z. nemorale的化学多样性和生物学潜力奠定了基础。