巴西樟科植物圆锥内氏樟（Endlicheria paniculata）不同组织精油化学成分及其α-葡萄糖苷酶与乙酰胆碱酯酶抑制活性、杀蚊幼虫潜力与分子对接研究

《Chemistry & Biodiversity》：α-Glucosidase and Acetylcholinesterase (AChE) Inhibitory Activities, Larvicidal Potential and GC–MS Analysis of Endlicheria paniculata: A Combined Experimental and Molecular Docking Study

　　

摘要专业翻译 来自圆锥内氏樟（Endlicheria paniculata）不同组织的精油通过气相色谱-质谱联用（GC–MS）进行表征，结果显示其富含倍半萜类化合物。主要成分为叶片中的amorpha-4,9-dien-2-ol（41.12%）、木材中的β-muurola-4,10(14)-dien-1-ol（43.54%）以及树皮中的桉叶油醇（spathulenol，18.56%）。在初步单浓度筛选试验中，叶片精油对α-葡萄糖苷酶（98.44%）和乙酰胆碱酯酶（AChE）（97.71%）表现出初步体外抑制潜力，同时对埃及伊蚊（Aedes aegypti）显示出中等程度的杀幼虫活性。分子对接模拟补充了上述初步生物学发现，表明叶片主要成分（尤其是amorpha-4,9-dien-2-ol和selina-3,7(11)-diene）对埃及伊蚊AChE-1表现出有利的预测结合相互作用，主要由疏水相互作用驱动。总体而言，这些发现为E. paniculata挥发性成分作为病媒控制研究和详细生物导向酶抑制研究的候选物质提供了理论见解和支持。

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一、研究背景与研究意义

神经退行性疾病与酶功能紊乱密切相关，其中乙酰胆碱酯酶（AChE）是关键酶之一，其主要功能是终止胆碱能运动神经元介导的神经传递。AChE功能异常可导致重症肌无力、帕金森病等神经和神经肌肉疾病。此外，以认知退化和记忆丧失为特征的阿尔茨海默病在全球范围内呈上升趋势，与高龄、社会因素、高血压、糖尿病等多种条件相关。在2型糖尿病中，胰岛素抵抗不仅影响外周组织，还损害大脑中该合成代谢激素的信号传导，增加阿尔茨海默病风险。α-葡萄糖苷酶是催化碳水化合物消化最后阶段的关键酶，其抑制剂可减缓复合碳水化合物释放葡萄糖并延迟其吸收。

然而，目前用于治疗阿尔茨海默病的合成药物存在疗效有限和不良反应显著等局限性；2型糖尿病的常规药物同样面临不良反应、长期疗效降低和血糖控制困难等问题。这些局限性凸显了探索具有更安全和更可持续治疗特征天然替代品的必要性。在此背景下，精油作为具有多种生物活性的天然芳香物质，已成为有前景的研究对象。精油不仅对中枢神经系统具有治疗作用，还表现出生物杀虫和杀幼虫活性，可作为合成杀虫剂的有前景替代品。

埃及伊蚊是寨卡、基孔肯雅热、黄热病和登革热等虫媒病毒的重要传播媒介，全球登革热每年导致1亿至4亿新感染病例，有效控蚊对预防这些疾病至关重要。本研究聚焦于樟科（Lauraceae）内氏樟属植物圆锥内氏樟（Endlicheria paniculata），该属已有研究显示其多种物种具有抗菌、抗氧化、抗利什曼原虫、抗炎和抗增殖活性，但针对该物种精油化学成分及其酶抑制和杀幼虫活性的系统研究尚属空白。

二、研究内容与主要结论

研究人员对E. paniculata的叶片、树皮和木材三个组织的精油进行了系统研究。精油提取率方面，粉碎干叶为1.8%，树皮为0.14%，木材为0.08%。GC–MS分析共鉴定出25种成分，以倍半萜烃及其含氧衍生物为主。木材精油中β-muurola-4,10(14)-dien-1-ol为主要成分（43.54%），树皮精油以spathulenol为主（18.56%），叶片精油则以amorpha-4,9-dien-2-ol为绝对主要成分（41.12%），其次为selina-3,7(11)-diene（16.21%）和β-muurola-4,10(14)-dien-1-ol（9.05%）。含氧倍半萜在所有组织中均为最主要化学类别，木材中占62.74%，树皮中占59.58%，叶片中占58.22%。这种组织特异性分布表明该物种存在代谢特化现象。amorpha-4,9-dien-2-ol作为叶片主要成分的发现是该属罕见的化学分类学标志，区别于同属其他物种如E. arenosa和E. bracteolata（后者以倍半萜烃为主，分别占77.6%和85.8%）。

由于树皮和木材提取率低，生物学评价仅聚焦于叶片精油。初步单浓度筛选显示，叶片精油对AChE的抑制率达97.71%，对α-葡萄糖苷酶的抑制率达98.44%，均超过50%的候选判定阈值，显示出显著的初步抑制潜力。杀幼虫试验显示，叶片精油对埃及伊蚊三龄幼虫表现出浓度依赖性死亡率，在1000 μg/mL浓度下死亡率达77.50%，半数致死浓度（LC₅₀）为61.56 μg/mL（95%置信区间：22.23–140.78 μg/mL），根据既定分类框架属于中等活性，显示出有前景的杀蚊幼虫潜力。分子对接模拟以埃及伊蚊功能性AChE-1（UniProt Q6A2E2）为靶标，模型质量验证良好（GMQE=0.83，序列一致性92.58%，拉曼钱德兰图最有利区域残基占95.14%）。对接结果显示，除tetradecanal外，所有主要成分均表现出有利的结合能（≤?6.0 kcal/mol），其中viridiflorol和selina-3,7(11)-diene得分最高（?7.4 kcal/mol），与阳性对照新斯的明和temephos-oxon相当。相互作用分析表明这些化合物主要建立疏水相互作用，β-muurola-4,10(14)-dien-1-ol、viridiflorol和amorpha-4,9-dien-2-ol还形成氢键。viridiflorol和selina-3,7(11)-diene均位于AChE-1催化峡谷内，靠近催化Ser200残基，物理性阻塞了催化三联体的通道。

三、主要关键技术方法

研究人员采用水蒸气蒸馏法（Clevenger装置，6小时）分别提取E. paniculata叶片、树皮和木材的精油，样品于2023年4月采集自巴西巴拉那州马蒂尼奥斯市Saint-Hilaire-Lange国家公园（坐标25.7902°S, 48.5618°W等），标本存放于库里蒂巴市植物博物馆标本馆（凭证号MBM46834），研究获SisGen授权（No. AFB5575）。化学成分分析采用气相色谱-质谱联用（GC–MS）和气相色谱-火焰离子化检测器（GC-FID），成分鉴定依据保留指数和质谱比对（MSI Level 2标准）。酶抑制试验采用比色法：α-葡萄糖苷酶抑制试验以4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）为底物，阿卡波糖为阳性对照；AChE抑制试验采用Ellman法，新斯的明为阳性对照。杀幼虫活性试验以埃及伊蚊Rockefeller株三龄幼虫为对象，采用概率分析（probit analysis）计算LC₅₀。分子对接采用AutoDock Vina软件，以同源建模构建埃及伊蚊AChE-1三维结构。

四、研究结果分述

4.1 GC–MS化学组成分析与精油得率：E. paniculata精油得率以叶片最高（1.8%），显著高于树皮（0.14%）和木材（0.08%）。三个组织共鉴定25种成分，含氧倍半萜为最丰富类别（木材62.74%、树皮59.58%、叶片58.22%）。木材以β-muurola-4,10(14)-dien-1-ol为主（43.54%），树皮以spathulenol为主（18.56%），叶片以amorpha-4,9-dien-2-ol为主（41.12%）。组织间倍半萜类别的相对丰度差异提示该物种存在组织依赖性次生代谢物分布和代谢特化。amorpha-4,9-dien-2-ol作为叶片主要成分是该属罕见的化学分类学标志，具有新颖性和化学系统学意义。

4.2 α-葡萄糖苷酶与乙酰胆碱酯酶抑制活性：叶片精油在初步单浓度筛选中对AChE和α-葡萄糖苷酶均表现出超过97%的高抑制率，达到有前景候选物的判定标准。这是首次报道内氏樟属精油具有酶抑制活性。与樟科其他物种相比，Laurus nobilis叶片精油对α-葡萄糖苷酶抑制率超过90%，Beilschmiedia madang叶片油对AChE抑制率为55%，E. paniculata的抑制水平处于较高范围。高抑制活性被初步归因于其丰富的亲脂性倍半萜组分，特别是含氧衍生物amorpha-4,9-dien-2-ol，其紧凑疏水骨架和极性官能团可通过疏水接触和氢键锚定于活性位点口袋。

4.3 杀幼虫活性：叶片精油对埃及伊蚊幼虫表现出浓度依赖性毒性，24小时暴露后最高浓度（1000 μg/mL）下死亡率达77.50%。概率分析得出LC₅₀为61.56 μg/mL（95% CI: 22.23–140.78 μg/mL），属于中等活性类别。与樟科其他物种相比，Aniba rosaeodora精油LC₅₀为41.07 mg/L，Ocotea nutans为250 μg/mL，Neolitsea ellipsoidea（富含(E)-β-罗勒烯87.6%）为6.59 μg/mL，E. paniculata的活性处于有竞争力水平。研究推测其杀幼虫机制可能涉及AChE抑制导致的神经毒性，以及高浓度下对幼虫组织学完整性的破坏。这是首次报道内氏樟属精油对埃及伊蚊的杀幼虫活性。

4.4 分子对接：同源建模构建的埃及伊蚊AChE-1模型质量可靠（GMQE=0.83，序列一致性92.58%，Ramachandran图最有利区域95.14%）。对接验证通过重对接共结晶抑制剂实现（RMSD<2.0 ?）。除tetradecanal外，所有主要成分均显示有利结合能（≤?6.0 kcal/mol），viridiflorol和selina-3,7(11)-diene得分最高（?7.4 kcal/mol），与阳性对照相当。相互作用以疏水接触为主，部分化合物形成氢键。两种最优配体均定位于催化峡谷内，靠近催化Ser200残基，物理性阻塞催化三联体通道，支持AChE活性峡谷阻塞作为观察到的生物活性的合理结构假说。

五、讨论总结与研究结论

本研究首次全面表征了E. paniculata的挥发性成分谱，揭示了倍半萜类化合物在组织间的特异性分布：木材精油以β-muurola-4,10(14)-dien-1-ol为主，树皮精油以spathulenol为主，而叶片精油以罕见的含氧倍半萜amorpha-4,9-dien-2-ol为绝对主要成分。这一发现是该属重要的化学分类学标志，因为该化合物作为主要成分的报道在文献中极为罕见。叶片精油在实验室条件下对埃及伊蚊表现出杀幼虫活性，同时对AChE和α-葡萄糖苷酶显示出超过97%的初步体外抑制潜力。分子对接模拟进一步表明，除tetradecanal外，精油主要成分对埃及伊蚊AChE-1均表现出有利的预测结合能，其中viridiflorol和selina-3,7(11)-diene复合物得分最高（?7.4 kcal/mol），与商业参考对照新斯的明和temephos-oxon相当，其结合主要由疏水相互作用和与催化三联体（Ser200）的邻近性驱动。这些发现将E. paniculata定位为值得进一步研究生物活性天然产物的相关植物物种，为樟科植物化学提供了原创性的多学科贡献，并为后续确定详细抑制动力学参数（IC₅₀和K_i）及通过生物导向分离鉴定具体活性代谢物奠定了基础。