《Food Frontiers》：Alpinetin Protects Against High-Fat Diet-Induced Hepatic Injury via Mitigating Oxidative Stress, and Ferroptosis Through Modulating LXRα
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非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的发病率随代谢综合征的流行而不断上升。本研究旨在利用体内和体外模型探讨山姜素（alpinetin）对肝损伤的作用及其潜在机制。研究人员给小鼠喂食高脂饮食（HFD），随后给予高剂量或低剂量的山姜素处理。体外实验中，研究人员采用棕榈
非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的发病率随代谢综合征的流行而不断上升。本研究旨在利用体内和体外模型探讨山姜素（alpinetin）对肝损伤的作用及其潜在机制。研究人员给小鼠喂食高脂饮食（HFD），随后给予高剂量或低剂量的山姜素处理。体外实验中，研究人员采用棕榈酸（PA，1 mM）诱导小鼠原代肝细胞脂质沉积，并以不同剂量的山姜素进行处理。研究发现，山姜素通过调节甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL）水平以及肝组织的病理学改变，剂量依赖性地减轻了HFD诱导的肝损伤。此外，山姜素还逆转了HFD诱导的脂质合成相关基因（乙酰辅酶A羧化酶1 [Acc1]、固醇调节元件结合蛋白1c [Srebp1c]、硬脂酰辅酶A去饱和酶-1 [Scd1]）的上调以及肝组织中的脂质蓄积。HFD喂养还诱导小鼠发生氧化应激和铁死亡，而山姜素给药可剂量依赖性地显著减轻这些变化。类似地，山姜素以剂量依赖方式显著减少PA诱导的细胞凋亡、脂质蓄积、线粒体功能障碍、氧化应激和铁死亡。在机制上，山姜素逆转了HFD或PA诱导的小鼠肝组织和肝细胞中肝X受体α（LXRα）的下调。过表达LXRα可保护小鼠肝细胞免受PA诱导的损伤。拯救实验表明，LXRα缺陷可抵消山姜素对PA诱导肝细胞损伤的保护作用。总之，山姜素通过调控LXRα改善HFD诱导的小鼠肝损伤及PA诱导的小鼠肝细胞损伤。
一、研究背景与研究目的
非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是目前最常见的慢性肝病，以无过量饮酒情况下的肝脏脂肪变性为特征，已成为近年来重要的全球性健康问题。NAFLD与肥胖、胰岛素抵抗、2型糖尿病、高血压、高脂血症及代谢综合征密切相关，据估计影响美国约25%的成年人，其发病率预计将随肥胖和2型糖尿病患病率的上升而持续增长。目前，以减重为目标的生活方式干预是管理NAFLD的主要手段，药物治疗选择十分有限，仅维生素E和吡格列酮为主要推荐方案。因此，阐明NAFLD的发病机制并开发有效的治疗药物对于改善患者预后和治疗至关重要。
山姜素（alpinetin，C16H14O4）是一种天然黄酮类化合物，存在于多种药用植物中，是多种中成药的常见成分。已有研究表明山姜素具有抗肿瘤、抗炎、保肝、肺保护和神经保护等作用，并能通过激活核因子E2相关因子2（Nrf2）通路和抑制NLRP3通路减轻四氯化碳诱导的肝纤维化和肝损伤。然而，山姜素在高脂饮食（HFD）诱导肝损伤背景下的保肝作用的具体机制尚未完全阐明。
肝X受体（LXR）属于核受体超家族中的配体激活转录因子，是胆固醇稳态、脂质代谢和炎症反应的重要调节因子。其中LXRα在肝细胞、巨噬细胞、脂肪组织、肾脏和肾上腺中高表达，在调节肝脏脂质代谢和细胞胆固醇稳态中发挥关键作用。LXRα信号失调与NAFLD和非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的发病机制密切相关。既往研究提示，黄酮类化合物如柚皮素、木犀草素、槲皮素和黄芩苷可在代谢性疾病条件下调节LXRα活性和表达。基于上述发现以及LXRα在肝脏脂质代谢和NAFLD进展中的已知作用，研究人员假设山姜素可能通过调控LXRα信号发挥保肝作用。然而，山姜素、LXRα、氧化应激和铁死亡在NAFLD中的关系尚不清楚。为此，本研究在HFD诱导的小鼠肝损伤模型和棕榈酸（PA）诱导的肝细胞损伤模型中，重点探讨了LXRα在山姜素调节脂质蓄积、氧化应激、线粒体功能障碍、细胞凋亡和铁死亡中的作用。
二、研究内容与主要技术方法
研究人员将50只雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组（n=30）和HFD组（n=50），对照组喂食标准饲料，HFD组喂食高脂饮食（60 kcal%脂肪，D12492，Research Diets，美国），持续16周。山姜素处理于HFD喂养第8周开始，持续8周，剂量为25 mg/kg/天（低剂量）或50 mg/kg/天（高剂量）。另设HFD+LXRα激动剂组，于第12周开始腹腔注射LXRα激动剂T0901317（30 mg/kg/天），持续4周。体外实验从小鼠分离原代肝细胞，以PA（1 mM）诱导脂毒性损伤，并用25 μg/mL或50 μg/mL山姜素处理24小时。主要技术方法包括：苏木精-伊红（H&E）染色和Kleiner评分系统评估肝脏组织病理学改变；油红O染色检测脂质蓄积；生化分析检测血清和肝组织中的ALT、AST、TG、TC、HDL、LDL、MDA、SOD、4-HNE、GSH/GSSG比值和铁含量；Western blot检测脂质合成、凋亡、铁死亡和LXRα相关蛋白表达；qRT-PCR检测脂肪酸氧化和脂质转运相关基因表达；流式细胞术检测细胞凋亡和活性氧（ROS）水平；JC-1染色检测线粒体膜电位；细胞核质分离实验检测LXRα亚细胞定位；通过LXRα过表达质粒（oe-LXRα）和shRNA（sh-LXRα）转染进行功能获得和功能丧失实验；使用铁死亡抑制剂ferrostatin-1（Fer-1）验证铁死亡参与。
三、研究结果
3.1 山姜素改善HFD诱导的小鼠肝损伤
HFD喂养导致小鼠体重、肝脏重量和肝/体重比显著增加，血清ALT、AST、HDL和LDL水平明显升高。山姜素处理剂量依赖性地逆转了上述改变，表明山姜素有效减轻HFD诱导的小鼠肝损伤。
3.2 山姜素减轻HFD喂养小鼠的肝脏脂肪变性、脂质蓄积和细胞凋亡
HFD显著增加血清和肝组织TG和TC水平，诱导肝脏炎症、脂肪变性和气球样变，升高NAFLD活动度评分（NAS），并上调脂质合成相关基因（Acc1、Srebp1c、Scd1）表达，同时降低Bcl-2表达、升高Bax和cleaved Caspase-3表达。山姜素剂量依赖性地改善所有这些异常，表明其有效减轻HFD诱导的肝脏脂质蓄积和细胞凋亡。
3.3 山姜素抑制HFD诱导的体内氧化应激和铁死亡
HFD喂养导致血清和肝组织中MDA水平升高、SOD水平降低，肝组织4-HNE含量升高、GSH/GSSG比值降低、铁含量增加，GPX4蛋白表达下调而COX2和ACSL4表达上调，同时降低PPARα、Cpt1α和Pgc1α表达并升高Cd36表达。山姜素剂量依赖性地逆转了这些改变，表明其有效缓解HFD诱导的氧化应激和铁死亡。
3.4 山姜素减轻PA诱导的原代小鼠肝细胞脂质蓄积和细胞凋亡
CCK-8实验显示25和50 μg/mL山姜素对细胞活力无明显影响，而100和200 μg/mL具有细胞毒性。PA处理显著增加肝细胞凋亡率、LDH释放和脂质蓄积，上调Acc1、Srebp1c和Scd1表达，降低Bcl-2并升高Bax和Caspase-3表达。山姜素剂量依赖性地改善这些异常。
3.5 山姜素恢复PA处理肝细胞的线粒体稳态并抑制铁死亡
PA处理导致线粒体膜电位降低、线粒体质量增加、细胞色素c表达升高、ROS水平升高、4-HNE和MDA含量增加、SOD水平和GSH/GSSG比值降低、铁含量增加，GPX4下调而COX2和ACSL4上调，同时PPARα、Cpt1α和Pgc1α表达降低而Cd36升高。山姜素剂量依赖性地逆转了所有这些改变。
3.6 LXRα保护肝细胞免受脂毒性损伤
HFD喂养小鼠肝组织和PA处理肝细胞中LXRα表达显著降低，山姜素剂量依赖性地恢复其表达。过表达LXRα显著减轻PA诱导的脂质蓄积、细胞凋亡、线粒体膜电位降低和ROS升高，恢复GPX4表达并抑制COX2和ACSL4表达，同时恢复PPARα、Cpt1α和Pgc1α表达并抑制Cd36表达。
3.7 LXRα的药理学激活保护HFD诱导的肝损伤和铁死亡
LXRα激动剂T0901317处理显著减轻HFD小鼠的体重增加、肝脏重量和肝/体重比升高，降低血清和肝脏TG、TC水平以及血清ALT、AST、HDL和LDL水平，减轻肝脏病理损伤和脂质蓄积，降低肝组织铁含量，恢复GPX4表达并抑制COX2和ACSL4表达，同时恢复凋亡相关蛋白和脂肪酸氧化基因的正常表达模式。
3.8 LXRα是山姜素在肝细胞中发挥保护作用所必需的
沉默LXRα（sh-LXRα）后，山姜素对PA诱导的细胞凋亡、脂质蓄积、ROS产生、线粒体膜电位降低、GPX4下调以及COX2和ACSL4上调的保护作用均被显著削弱，山姜素对PPARα、Cpt1α和Pgc1α的上调及对Cd36的下调作用也被逆转。
3.9 山姜素促进肝细胞中LXRα核转位
亚细胞分级实验显示，PA处理降低细胞质和细胞核中LXRα水平，山姜素恢复总LXRα表达并显著增加LXRα的核蓄积，使核/质比值升高。LXRα沉默后该效应被消除，证实了山姜素介导的LXRα激活的特异性。
3.10 铁死亡抑制模拟山姜素在PA处理肝细胞中的保护作用
铁死亡抑制剂Fer-1显著减少PA诱导的脂质蓄积、恢复线粒体膜电位、降低ROS水平，并恢复GPX4表达、抑制COX2和ACSL4表达，效果与山姜素相当。Fer-1与山姜素联合处理未产生额外保护效应，表明两者通过共享的抑制铁死亡机制发挥作用。
四、讨论与结论
讨论部分指出，NAFLD已成为慢性肝病的主要原因和肝相关死亡的重要贡献者，但有效治疗选择仍然匮乏。本研究证实山姜素在体内和体外均能保护肝脏免受脂毒性损伤。机制上，山姜素不仅抑制脂质合成（下调Acc1、Srebp1c、Scd1），还促进脂质利用（恢复PPARα、Cpt1α、Pgc1α表达并抑制Cd36），改善整体肝脏代谢稳态。山姜素通过恢复线粒体功能、维持氧化还原稳态来减轻氧化应激。更重要的是，本研究首次揭示山姜素通过抑制铁死亡发挥保肝作用：山姜素降低铁蓄积、恢复GSH/GSSG比值、减少脂质过氧化标志物、恢复正常GPX4、ACSL4和COX2表达，且Fer-1处理基本模拟了山姜素的保护效果，联合处理无叠加效应，证实抑制铁死亡是山姜素保护肝细胞的重要机制。研究还鉴定LXRα为山姜素保肝活性的关键介质：HFD和PA均降低LXRα表达，山姜素剂量依赖性地恢复其表达；过表达LXRα模拟山姜素效应，LXRα激动剂在体内重现山姜素的保肝、抗氧化和抗铁死亡作用，而沉默LXRα则基本消除山姜素的保护效应。尤为新颖的发现是，山姜素不仅恢复LXRα表达，还促进其核转位，增强其转录活性，这提示最终生物学结局可能更依赖于核内LXRα活性而非单纯总蛋白丰度。与合成FXR激动剂奥贝胆酸（OCA）相比，山姜素具有不同的多靶点药理特征，可同时改善肝脏脂肪变性、氧化应激、铁死亡和系统性血脂异常，支持其作为NAFLD天然来源的多靶点治疗候选药物的潜力。
结论部分：总之，研究数据表明，山姜素通过调控LXRα信号，减轻了HFD诱导的体内脂质蓄积、氧化应激、铁死亡和肝损伤，以及PA诱导的体外肝细胞损伤。该研究不仅证实了山姜素既往报道的降脂和抗氧化作用，还揭示了其抑制铁死亡的新作用，从而为其保肝作用提供了更全面的机制理解。与OCA等合成FXR激动剂相比，山姜素具有独特的多种靶点药理学特征，在脂质稳态和铁死亡方面具有同步获益，支持其作为NAFLD安全有效的天然替代疗法的潜力。
