基于捕获离子迁移谱（TIMS）的CIDtims工作流提升Middle-Down蛋白质组学序列覆盖

《JOURNAL OF MASS SPECTROMETRY》：Augmenting Middle-Down Sequence Coverage With Trapped Ion Mobility Spectrometry

Middle-down蛋白质组学已成为传统bottom-up工作流的有吸引力的替代方案，因为它更好地保留序列信息，并可注释同时存在的翻译后修饰（PTMs）。这由限制性蛋白酶解步骤促进，该步骤产生比bottom-up工作流中通常所见更大的多肽。这些较大的肽段可携带多个PTMs，在色谱分离过程中更不易丢失，因此比bottom-up报告更高比例的蛋白质序列。然而，对这些肽段进行测序可导致复杂的串联质谱图、产物离子重叠、信噪比降低和测序效率下降。离子迁移谱与串联质谱的耦合已证明能够去卷积重叠的产物离子、改善信噪比并增加蛋白质离子的序列覆盖。在本工作中，研究人员利用捕获离子迁移谱（TIMS）去卷积这些复杂的产物离子混合物并提高middle-down肽段的序列覆盖。研究人员证明，该TIMS工作流可与色谱分离有效耦合。研究人员评估了质量从12-kDa细胞色素到150-kDa免疫球蛋白G的四种蛋白质，发现虽然对细胞色素c等小蛋白的收益很小，但分别测得肌红蛋白、碳酸酐酶和NIST抗体的肽段覆盖显著增加43.8%、24.5%和39.9%。研究人员可以得出结论，TIMS是提高middle-down工作流中序列覆盖的有效方法。

蛋白质组学工作流的目标是确定检测蛋白的序列和身份，并注释PTMs的存在与精确位置。历史上直接分析完整蛋白受电离、传输和气相测序挑战限制，因此常先酶解。Bottom-up（自下而上，以肽段为中心的工作流）针对0.7–3 kDa肽段，经HPLC分离和MS/MS测序效率高，可实现高序列覆盖和PTM定位；但广泛消化产生复杂肽混合物，部分肽可能因数据依赖采集（DDA）半随机算法未被选择测序，且过疏水、过亲水或过小肽难以有效分析，导致蛋白质信息不完整并可能漏检关键PTMs。Top-down（自上而下，完整蛋白分析）可直接分析完整蛋白，但灵敏度低于肽段方法，随蛋白质量增加序列覆盖和PTM精确定位能力下降。Middle-down（中下，限制酶解产生较大肽段）是bottom-up与top-down的折中，通过限制酶解产生3–25 kDa肽段，更好保留序列信息并可注释并发PTMs；有限酶解产生少量大肽，降低样本复杂性，且较长肽段不易过疏水或过亲水，通常可获得覆盖全序列的高肽段覆盖。然而大肽经碰撞诱导解离（CID）产生复杂串联质谱，近同量异位离子同位素分布重叠和低信噪比（S/N）妨碍产物离子注释。离子迁移谱（IMS）已用于类似挑战；TIMS可去卷积重叠产物离子、改善S/N并增加完整蛋白离子测序的序列覆盖。因此研究人员开展本工作，检验基于TIMS的CID_tims工作流能否与液相色谱分离结合并显著提高middle-down序列覆盖，评估12–150 kDa蛋白标准品。其意义在于为middle-down提供可兼容液相色谱的TIMS增强测序策略，在不损失完整肽段覆盖的前提下提高序列覆盖。

关键技术方法（≤250字）：样本为马心细胞色素c、马心肌红蛋白、牛红细胞碳酸酐酶（Sigma-Aldrich）和NIST抗体RM 8671（Agilent Technologies）。Bottom-up经胰蛋白酶消化后行HPLC–MS/MS，在timsTOF上以DDA进行CID。Middle-down小蛋白用2%甲酸80°C 2 h酸水解；NIST抗体经IdeS切铰链区并还原，C4反相HPLC分离后进timsTOF。CID_tims在TIMS内提高Δ6传输电压并降低气压实现解离，无前级四极杆隔离、数据非依赖采集；产物离子按迁移率分箱，MASH Native/eTHRASH去卷积，bottom-up用MaxQuant，质量容差10 ppm，FDR 1%。

3 结果与讨论：研究人员先以bottom-up比较四种蛋白。测得细胞色素c、肌红蛋白、碳酸酐酶和抗体（轻链LC与重链合并）的肽段覆盖分别为88%、95%、95%和90%；CID序列覆盖分别为71.5%±0.6%、81.4%±0.4%、84.9%±0.2%和78.6%±0.2%。为生成middle-down大肽，小蛋白经酸水解分别产生2、3、4个肽，覆盖全部序列，肽段覆盖100%；合并多电荷态测序结果后，肌红蛋白、细胞色素c和碳酸酐酶的序列覆盖分别为46.0%±0.6%、53.7%±0.6%和54.8%±0.6%，低于bottom-up。NIST抗体经IdeS切割和还原产生LC、Fd′、Fc/2约25 kDa亚基，肽段覆盖100%；CID序列覆盖分别为LC 29.1%±0.3%、Fc/2 25.7%±0.5%、Fd′ 10.4%±0.2%，与Srzenti? et al.近期实验室间研究报道的CID结果相当。

3.1 离子迁移谱辅助的Middle-Down测序：将CID_tims用于酸水解肽。碳酸酐酶98 aa肽显示解离效率依赖电荷态，高电荷态完全耗尽而低电荷态存活，产物离子分布于迁移率维度。合并后肌红蛋白、细胞色素c和碳酸酐酶的序列覆盖分别为66.2%±0.4%、58.9%±0.6%和68.2%±0.4%，较CID提高9.6%、43.8%和24.5%，但仍低于bottom-up；改善源于S/N提高和重叠同位素分布分离。抗体亚基经CID_tims后，LC序列覆盖41.4%±0.3%（提高42%），Fc/2为28.3%±0.6%（提高10%），Fd′为20.7%±0.2%（提高100%）；合并全抗体序列覆盖29.8%±0.2%，提高39.9%。结果表明TIMS可去卷积重叠离子、改善S/N并提高middle-down肽段序列覆盖，且与HPLC分离兼容；小蛋白收益有限，中至大型蛋白收益更大。

讨论表明，CID_tims可成功用于采用液相色谱分离的middle-down方案，并显著提高序列覆盖。研究结论（译）：虽然细胞色素c等小蛋白仅显示约9.6%的序列覆盖增加，但肌红蛋白等中等质量蛋白的序列覆盖从标准CID的46.1%±0.7%升至CID_tims的66.2%±0.4%；碳酸酐酶在采用IMS分离后从54.8%±0.6%升至68.2%±0.4%；应用于NIST IgG抗体时也观察到类似收益，序列覆盖从21.4%±0.09%升至29.8%±0.2%。这些趋势表明最大改善出现在中至高质量范围，符合预期，因为这些蛋白会产生更复杂的串联质谱并从IMS分离中获益最多。本工作证明CID_tims工作流可成功用于采用液相色谱分离的方案，并显著提高middle-down肽段的序列覆盖，其中肌红蛋白、碳酸酐酶和NIST抗体的序列覆盖改善分别为43.8%、24.5%和39.9%。