TRPA1阻断增强铁死亡驱动的原位疫苗纳米平台用于三阴性乳腺癌的强化ROS免疫治疗

《Materials Today Bio》：TRPA1 Blockade Potentiates a Ferroptosis-Driven In Situ Vaccine Nanoplatform for Enhanced ROS Immunotherapy against TNBC

　　

三阴性乳腺癌（TNBC）的治疗受限于化疗耐药和较差的免疫治疗应答。基于活性氧（ROS）的治疗方式，包括声动力治疗（SDT）和化学动力治疗（CDT），具有应用前景，但受到肿瘤细胞内在抗氧化防御系统的限制。TRPA1作为一种氧化还原敏感的钙通道，在TNBC细胞的氧化防御程序中充当关键调节器。通过维持钙内流，TRPA1缓冲氧化应激并抑制ROS介导的杀伤，从而增强对ROS疗法的抵抗性。TRPA1阻断代表了一种有前景的策略，既能增敏肿瘤细胞对氧化损伤的敏感性，又能放大SDT/CDT触发的免疫原性效应。在此，研究人员将这一TRPA1阻断策略整合入基于FeMOF的纳米平台（FMHG-HA）中，该平台共递送葡萄糖氧化酶（GOx）和HC-030031，并用透明质酸（HA）进行肿瘤相关递送。GOx消耗葡萄糖并在原位生成H₂O₂，为Fenton样反应提供燃料，实现自供能CDT。超声（US）进一步放大ROS产生，与CDT协同驱动脂质过氧化和GPX4下调。同时，HC-030031消除TRPA1介导的钙内流，清除耐受缓冲，并将细胞死亡模式从凋亡转向铁死亡。在原位4T1模型中，FMHG-HA介导的CDT/SDT在US照射下显著抑制肿瘤进展并减少肺转移。值得注意的是，铁死亡释放的损伤相关分子模式（DAMPs）将死亡肿瘤细胞转化为个体化抗原储库，引发原位疫苗样免疫激活，促进树突状细胞成熟和CD8⁺ T细胞浸润，有效将免疫学“冷”肿瘤转化为“热”肿瘤。总之，FMHG-HA将TRPA1靶向离子干预与多模式氧化治疗相结合，代表了一种以铁死亡为引擎、原位疫苗样免疫激活为功能输出的TNBC治疗策略。

三阴性乳腺癌（TNBC）的治疗长期受限于化疗耐药和较低的免疫治疗应答率，基于活性氧（ROS）的疗法如声动力治疗（SDT）与化学动力治疗（CDT）虽展现出潜力，却因肿瘤细胞固有的抗氧化防御系统而疗效受限。传统ROS纳米平台多聚焦于化学增敏以提高ROS产量，却忽视了离子通道介导的应激适应机制。瞬时受体电位锚蛋白1（TRPA1）作为氧化还原敏感的钙通道，在多种肿瘤中异常高表达，肿瘤微环境中的ROS可激活并触发钙内流，启动抗凋亡存活信号，使肿瘤细胞耐受ROS疗法。该研究发表于《Materials Today Bio》，提出以药理学TRPA1阻断作为“主开关”解除这一代偿性防御，并将此策略整合至FeMOF基纳米平台FMHG-HA中。平台共载葡萄糖氧化酶（GOx）与TRPA1抑制剂HC-030031，经透明质酸（HA）修饰实现肿瘤相关递送。GOx消耗葡萄糖原位生成H₂O₂，驱动Fe基Fenton样反应实现自供能CDT；超声（US）进一步放大ROS产生，协同驱动脂质过氧化与GPX4下调；HC-030031则阻断TRPA1介导的钙内流，瓦解氧化应激耐受，将细胞死亡模式由凋亡转向铁死亡。铁死亡释放的DAMPs（包括CRT暴露与HMGB1胞外释放）作为原位疫苗信号，促进树突状细胞成熟与CD8⁺ T细胞浸润，使免疫“冷”肿瘤转变为“热”表型。

主要技术方法：研究通过扫描电镜（SEM）、透射电镜（TEM）、动态光散射（DLS）、zeta电位和X射线光电子能谱（XPS）表征纳米平台结构与理化性质；利用电子自旋共振（ESR）、DPBF探针和TMB显色法检测ROS种类及催化活性；以4T1和MDA-MB-231细胞系评价体外杀伤、迁移侵袭、脂质过氧化（C11-BODIPY）、线粒体膜电位（JC-1）、胞内Fe²⁺（RhoNox-1）及Ca²⁺水平（Fluo-4 AM），并通过Western blot检测GPX4、TRPA1和CRT表达；建立骨髓来源树突状细胞（BMDCs）共培养体系评估DC成熟；在4T1-Luc原位乳腺癌模型（BALB/c小鼠，尾静脉注射）中评价抗肿瘤疗效，并利用多色免疫荧光、ELISA及RNA-seq分析免疫微环境重塑与转录组变化。

结果部分总结如下：

2.1 制备与表征：通过配位驱动组装获得FMHG-HA，呈约200 nm簇状结构，表面电位由+24.1 mV反转为?18.6 mV，XPS证实Fe²⁺/Fe³⁺混合价态共存，HC释放呈pH与透明质酸酶（HAase）响应性，溶血率低于5%，表明平台兼具稳定性与生物相容性。

2.2 级联催化性能：ESR检测到DMPO-•O₂^-、TEMP-¹O₂及DMPO-•OH特征信号，DPBF与TMB实验证实US显著增强¹O₂和•OH产生，且GOx浓度依赖性催化证实完整的葡萄糖/H₂O₂/•OH级联反应，说明US辐照加速Fenton样动力学，实现SDT增强CDT。

2.3 抑制增殖与转移：FMHG-HA+US使4T1细胞死亡率超过65%，HSA模型显示平均协同分数22.04（p = 1.20 × 10^-5），克隆形成、划痕愈合与Transwell实验证实细胞增殖、迁移和侵袭能力被显著抑制，并在MDA-MB-231细胞中重复验证。

2.4 氧化损伤与线粒体功能障碍：DCFH-DA探针显示FMHG-HA+US引发强烈ROS爆发；JC-1染色显示线粒体膜电位几乎完全丧失（红色/绿色荧光比降至约0.1）；AO/PI双染证实大量细胞死亡，表明级联氧化应激造成不可逆的线粒体损伤。

2.5 铁死亡与TRPA1阻断：C11-BODIPY检测显示脂质过氧化显著升高；RhoNox-1证实胞内Fe²⁺池扩大；Western blot显示GPX4与TRPA1表达均明显下调；时间分辨成像显示TRPA1表达与胞内Ca²⁺水平同步下降，证实铁死亡诱导与离子通道干预协同作用。

2.6 ICD与DC成熟：免疫荧光显示FMHG-HA+US处理后HMGB1由核释放至胞外，CRT转位至质膜；与BMDCs共培养后，CD80⁺CD86⁺双阳性比例达11.8%，约为对照组的3.4倍，证明DAMPs有效激活抗原呈递细胞。

2.7 体内抗肿瘤疗效：在4T1-Luc原位模型中，FMHG-HA+US显著抑制肿瘤生长，生物发光信号持续减弱，肿瘤重量明显降低；肺组织H&E染色显示转移结节显著减少，小鼠体重稳定且主要器官无病理异常。

2.8 铁死亡激活与免疫重塑：IHC显示肿瘤组织GPX4下调、TRPA1荧光减弱；多重免疫荧光检测到CRT和胞外HMGB1表达增强，CD8⁺与CD3⁺ T细胞浸润显著增加；ELISA显示IL-6、IL-12、TNF-α和IFN-γ水平均升高，表明微环境由“冷”向“热”转变。

2.9 转录组学分析：RNA-seq显示处理组与对照组在PCA主轴上明显分离；GO富集揭示氧化应激、铁死亡、细胞周期阻滞、免疫激活及代谢重编程四个核心模块；GSEA证实钙信号（NES = ?1.347）与PI3K-Akt信号（NES = ?1.273）负富集，为机制提供了转录组学证据。

总结讨论认为，FMHG-HA的创新在于确立TRPA1作为肿瘤氧化应激耐受的关键节点，通过HC-030031解除该耐受，将传统ROS疗法升级为铁死亡驱动的免疫原性纳米平台；释放的DAMPs充当内源佐剂，激活DC和CD8⁺ T细胞，在TNBC模型中同时实现局部肿瘤消融与远处转移抑制。结论翻译为：FMHG-HA将TRPA1靶向离子干预与多模式氧化治疗相结合，提供了一种以铁死亡为引擎、原位疫苗样免疫激活为功能输出的TNBC治疗策略；诱导的ICD可为免疫检查点抑制剂创造有利条件，有望改善TNBC对免疫治疗的应答。