柚皮素-Mn自供能双动态水凝胶通过级联催化与免疫调节修复MRSA感染糖尿病创面

《Materials Today Bio》：Naringenin-Mn self-fueling dual-dynamic hydrogel with cascade catalysis and immunomodulation properties for repairing MRSA-infected diabetic wounds

　　

糖尿病患者慢性感染创面因持续炎症、氧化应激及细菌耐药问题仍是重大临床挑战，在术后外科切口区域尤为突出，愈合受损可导致严重并发症。本研究旨在开发一种具有硼酸酯键和席夫碱键的自愈合级联催化水凝胶CS-PBA/ODex@NRGe-Mn（CPONM）。该水凝胶具有双动态网络结构，并负载具有超氧化物歧化酶/过氧化物酶样（SOD/POD-like）活性的柚皮素-Mn纳米颗粒（naringenin-Mn nanoparticles，NM NPs）。该水凝胶通过将CS-PBA溶液与含NM NPs的ODex溶液混合制备。CPONM具有高孔隙率、溶胀能力、黏附强度（13.43 kPa）及pH响应释放特性。体外研究显示，CPONM有效抑制大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）生长（93.15%）和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）生长（94.74%），破坏细菌生物膜最高达92%，并降低巨噬细胞中诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）和白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）表达。在MRSA感染的糖尿病小鼠创面模型中，CPONM加速创面愈合（第18天达97.47%），降低细菌感染风险，抑制核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）并激活核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）。组织病理学染色显示该水凝胶促进创面上皮化、胶原沉积和血管生长（血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、α-平滑肌肌动蛋白（alpha-smooth muscle actin，α-SMA））。第3天创面组织活性氧（reactive oxygen species，ROS）定量测量显示，O₂^·?降低0.32 μmol/g，而·OH增加18.7%，直接证明SOD和POD的“自供能”级联反应。因此，CPONM是治疗糖尿病患者感染性术后创面的一种有前景方法。

该论文发表于《Materials Today Bio》，作者Tong Li、Ming Qi、Chi Zhang、Jing Xue、Guofeng Dai、Gangpu Wang和Gengyu Chen围绕糖尿病感染创面修复开展研究。糖尿病患者慢性感染创面因持续炎症、氧化应激和细菌耐药成为临床难题，术后切口尤易感染；约25%糖尿病患者一生中发生慢愈创面，60-80%并发细菌感染，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）因耐药和生物膜形成尤其危险。传统聚乙烯醇/聚乙二醇水凝胶结构静态，难响应pH/活性氧（reactive oxygen species，ROS）动态变化；动态共价智能水凝胶虽具自愈合和刺激响应释放，但多为单向响应且依赖外源药物；现有纳米酶水凝胶多限于单酶级联。柚皮素（naringenin，NRGe）可抗炎、抑制核因子κB（NF-κB）并激活核因子E2相关因子2（Nrf2），但水溶性低、游离形式不稳定；与金属离子配位可提高稳定性和活性。基于此，研究人员构建苯硼酸接枝壳聚糖（CS-PBA）/氧化葡聚糖（ODex）@NRGe-Mn（CPONM）双动态自供能级联催化水凝胶，将硼酸酯键（boronate ester bond）和席夫碱键（Schiff base bond）网络与柚皮素-Mn纳米颗粒（naringenin-Mn nanoparticles，NM NPs）结合，利用创面堆积的O₂^·?为“燃料”，经超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）样活性转化为H₂O₂，再经过氧化物酶（peroxidase，POD）样活性生成·OH杀菌，同时NRGe发挥免疫调节作用。该研究为糖尿病感染术后创面提供了兼具抗菌、抗炎和促再生功能的多功能策略。

关键技术方法（≤250字）：研究人员制备NM NPs、CS-PBA和ODex，将CS-PBA与含NM NPs的ODex混合形成CPONM；采用TEM、SEM、EDS、ICP-MS、UV、FTIR、XRD、XPS、¹H-NMR、流变、黏附、溶胀、降解及pH/ROS响应释放评价材料；体外检测SOD/POD样活性、ABTS^·+/DPPH·清除、抗菌与抗生物膜、溶血/CCK-8、划痕迁移及LPS诱导RAW264.7巨噬细胞表型；体内采用链脲佐菌素诱导的2型糖尿病小鼠MRSA感染全层皮肤创面模型，进行创面愈合、组织匀浆菌落计数、ROS定量、H&E/Masson、免疫组化和Western blot分析。

研究结果：2.1 NM NPs表征：TEM、粒径、EDS、ICP-MS、UV、FTIR、XRD和XPS证实球形NM NPs约15.00 nm，Mn²⁺与NRGe配位，Mn以Mn²⁺为主。2.2 苯硼酸修饰壳聚糖表征：FTIR和¹H-NMR证实4-羧基苯硼酸与壳聚糖共价偶联，取代度约18.18%。2.3 氧化葡聚糖表征：¹H-NMR和FTIR证实醛基生成，氧化度56.8%，可兼顾席夫碱交联与硼酸酯键形成。2.4 水凝胶表征：SEM、EDS和FTIR证实三维多孔结构（孔径111.46 μm）、双动态网络形成及NM NPs均匀分布。2.5 孔隙率与溶胀：液置换法显示孔隙率85-87%，溶胀率1255.59%，利于渗出液吸收和细胞迁移。2.6 流变分析：G'大于G"，时间扫描稳定，说明双动态交联提供机械稳定性。2.7 黏附分析：金属、橡胶、玻璃和皮肤表面黏附，强度13.43 kPa。2.8 可注射性与自愈能力：可经针头注射，切断后5分钟自融合，源于动态键可逆性。2.9 pH/ROS响应释放：酸性和H₂O₂条件加速NRGe与Mn²⁺释放，证实微环境响应。2.10 体外降解：pH依赖降解，pH5.5残留33.39%，pH7.4残留52.75%，与释放同步。2.11 酶活性：NM NPs呈浓度依赖SOD样和POD样活性，可清除O₂^·?并分解H₂O₂。2.12 体外生物相容性：溶血率<3%，L929存活>100%，无明显急性毒性。2.13 抗氧化能力：ABTS^·+和DPPH·清除呈剂量依赖，NM NPs与壳聚糖协同抗氧化。2.1.4 细胞迁移实验：划痕实验显示CPONM组48小时闭合率58.99%，显著高于其他组。2.15 巨噬细胞表型：LPS诱导RAW264.7中CPONM降低iNOS和IL-6，抑制M1促炎表型。2.16 体外抗菌性能：菌落计数和结晶紫染色显示CPONM对E.coli抑菌93.15%、MRSA抑菌94.74%，生物膜抑制92.85%/91.04%。2.17 糖尿病MRSA感染创面愈合：小鼠模型显示CPONM第18天愈合97.47%，第9天抑菌93.85%，第3天O₂^·?降0.32 μmol/g、·OH增18.7%，验证自供能级联。2.18 组织病理染色：H&E/Masson显示CPONM完全上皮化、炎症轻、成熟I型胶原致密有序。2.19 免疫组化：CPONM降低CD86（M1巨噬细胞标志物），升高CD206（M2巨噬细胞标志物）、VEGF和α-SMA，促血管成熟与修复。2.20 Western blot：CPONM降低IL-1β、TNF-α及p-IκB-α/p-NF-κB，激活Nrf2/醌氧化还原酶1（NQO1）/血红素加氧酶-1（HO-1），抑炎并增强抗氧化。

讨论部分总结：讨论指出，CPONM利用感染糖尿病创面内源ROS为燃料，持续供·OH，克服静态水凝胶和单向释放局限；双动态交联赋予pH/ROS敏感释放、可注射、自愈和13.43 kPa黏附，适合潮湿术后创面；NM NPs兼有酶活和NRGe免疫调节，促M2极化、降iNOS/IL-6，抑NF-κB并激活Nrf2。动物模型第18天愈合97.47%，细菌负荷降98%，促VEGF/α-SMA血管生成、上皮化和胶原成熟。局限：Mn²⁺长期清除和器官蓄积未明；对其他临床菌株（如Acinetobacter baumannii、Pseudomonas aeruginosa）未验证；仅小面积皮肤缺损模型；CS-PBA和ODex规模化合成重复性待解决。

研究结论翻译：本研究成功开发了一种“自供能”双动态水凝胶（CPONM），其由硼酸酯键和席夫碱键交联网络与柚皮素-Mn配位纳米颗粒（NM NPs）结合而成。该系统可注射、自愈合且具组织黏附性，并能响应pH和ROS发生双响应降解和药物释放。NM NPs的协同释放触发两步级联反应：首先通过SOD样作用将内源性超氧阴离子转化为过氧化氢，随后通过POD样作用生成具有杀菌作用的羟基自由基；整个过程完全由病理性ROS蓄积驱动，无需外源刺激。同时，释放的柚皮素抑制NF-κB信号并激活Nrf2介导的抗氧化防御，促进巨噬细胞向修复型M2表型极化。在MRSA感染的糖尿病小鼠创面模型中，CPONM第18天创面闭合率达97.47%，从愈合早期起显著降低细菌负荷，并增强血管生成和胶原成熟。总之，本研究证明合理整合刺激响应递送平台、自供能催化级联和免疫调节黄酮类化合物，为应对慢性感染创面多因素病理机制提供了有前景策略，并在糖尿病患者中具有显著临床转化潜力。