CaO2/CZ/GOX级联纳米系统通过葡萄糖消耗与离子稳态扰动协同增强焦亡和铜死亡以激活抗肿瘤免疫

《Materials Today Bio》：Multifunctional Cascade Nanosystem Consumes Glucose to Trigger Enhanced Pyroptosis and Cuproptosis for Tumor Immunotherapy

　　

免疫原性细胞死亡（ICD）通过释放损伤相关分子模式（DAMPs）激发抗肿瘤应答，从而桥接局部治疗与系统性免疫激活。焦亡是一种促炎性细胞死亡模式，可诱导局部肿瘤死亡并释放细胞因子，促进免疫激活。本研究构建了多功能级联纳米系统CaO₂/Cu-ZIF8/GOX（CaO₂/CZ/GOX），其通过葡萄糖消耗、离子稳态扰动和铜死亡触发线粒体氧化应激，从而放大肿瘤焦亡。该纳米系统利用酸响应性Cu-ZIF8（CZ）作为载体负载CaO₂和葡萄糖氧化酶（GOX）。在酸性肿瘤微环境（TME）中，CaO₂启动级联H₂O₂生成，同时GOX消耗葡萄糖并催化生成H₂O₂，协同加剧离子稳态破坏和线粒体氧化应激。同时，Cu-ZIF8释放的Cu²⁺参与类芬顿反应生成羟基自由基（·OH），蓄积的Cu²⁺进一步触发FDX1介导的铜死亡。总体而言，这些事件导致活性氧（ROS）蓄积、离子稳态破坏和线粒体损伤，最终激活肿瘤细胞焦亡和铜死亡。体外和体内实验证实，CaO₂/CZ/GOX纳米颗粒（NPs）可高效消耗葡萄糖、在肿瘤中选择性蓄积并表现出良好生物相容性。此外，其显著抑制Hepa1-6肿瘤细胞增殖，有效抑制肿瘤复发并激活抗肿瘤免疫。总体而言，该纳米系统整合了代谢干预、氧化损伤、铜死亡、焦亡和免疫激活的级联，为肿瘤代谢调控和免疫微环境重塑提供了新策略。

肿瘤免疫治疗通过调动宿主免疫系统对抗肿瘤，但其疗效受肿瘤微环境（TME）固有免疫抑制的限制。免疫原性细胞死亡（ICD）通过释放损伤相关分子模式（DAMPs）连接局部治疗与系统性免疫激活。焦亡是Gasdermin介导的程序性细胞死亡，形态上表现为膜穿孔、肿胀和裂解，并释放炎性细胞因子和胞内内容物；经典通路中线粒体损伤和活性氧（ROS）蓄积激活NLRP3炎症小体，导致Caspase-1切割，活化Caspase-1将GSDMD加工为成孔N端片段，引起膜破裂并促进IL-1β和IL-18释放。焦亡释放HMGB1、CRT和ATP等DAMPs，增强CD8⁺ T细胞介导的肿瘤杀伤、缓解免疫抑制并形成正反馈。但有效焦亡需要强而持续的胞内应激，单疗常难以实现。铜死亡与线粒体三羧酸（TCA）循环紧密相关；过量Cu²⁺结合脂酰化TCA蛋白，促进其聚集和铁硫簇耗竭，引发蛋白毒性应激和线粒体损伤，FDX1通过将Cu²⁺还原为Cu⁺增强铜毒性。肿瘤细胞高度依赖有氧糖酵解，TME中过量葡萄糖抑制T细胞效应功能并驱动代谢免疫抑制；GOX介导的饥饿治疗消耗葡萄糖并产生H₂O₂。ZIF-8具有pH响应降解和高负载能力，Cu-ZIF8可释放Cu²⁺；CaO₂释放Ca²⁺和H₂O₂导致线粒体离子稳态紊乱。基于此，研究人员构建CaO₂/CZ/GOX多功能级联纳米系统，旨在通过葡萄糖消耗、离子稳态扰动、铜死亡和氧化应激协同放大焦亡并激活抗肿瘤免疫。该论文发表于《Materials Today Bio》。

关键技术方法概括：研究人员采用逐步自组装构建CaO₂/CZ/GOX NPs，样本来源包括Hepa1-6肝癌细胞、AML12正常肝细胞、Hepa1-6荷瘤小鼠及肿瘤再挑战模型。理化表征采用TEM、DLS、EDS元素映射、XRD、XPS、Zeta电位、FTIR、SDS-PAGE、ICP-OES和BCA；级联反应采用MB降解、葡萄糖消耗和H₂O₂生成检测；细胞水平采用荧光/流式摄取、CCK-8、活死染色、2-NBDG、DCFH-DA、JC-1、Rhod-2、Cu²⁺探针、共定位、免疫荧光、WB、LDH和IL-1β检测；体内采用荧光成像、H&E、血液生化、溶血、荷瘤治疗、流式免疫分型和肿瘤再挑战。

2.1 CaO₂/CZ/GOX NPs的制备与表征：通过TEM、DLS、EDS、XRD、XPS、Zeta电位、FTIR、SDS-PAGE、ICP-OES和BCA等研究，发现CZ框架使CaO₂由无序聚集转为均匀分散，GOX成功负载并保留活性，复合材料结构完整、胶体稳定，并呈pH响应性释放GOX和Ca²⁺。

2.2 体外级联反应评价：通过MB脱色、葡萄糖消耗和H₂O₂生成检测，发现pH 5.0下MB降解和H₂O₂生成显著增强且随葡萄糖浓度增加，说明酸性TME下纳米系统可激活级联催化，协同耗糖和产ROS。

2.3 细胞摄取与细胞毒性：通过荧光显微镜和流式检测罗丹明B标记NPs摄取，CCK-8和活死染色，发现Hepa1-6细胞摄取随时间增加，对AML12细胞毒性低、对Hepa1-6细胞毒性强，且CaO₂/CZ/GOX优于CaO₂、Cu-ZIF8、CaO₂/CZ，说明肿瘤酸性环境和高糖代谢可启动级联并产生协同杀伤。

2.4 葡萄糖消耗：通过葡萄糖检测试剂和荧光探针，发现CaO₂/CZ/GOX的胞内耗糖能力与游离GOX相当，说明载体负载后酶活保留，具备TME耗糖潜力。

2.5 线粒体氧化应激与铜死亡：通过DCFH-DA、JC-1、Rhod-2、Cu²⁺探针、共定位、免疫荧光和WB检测FDX1、LIAS、DLAT，发现CaO₂/CZ/GOX诱导最强ROS、最明显线粒体膜电位去极化、Ca²⁺和Cu²⁺线粒体富集与共定位，FDX1/LIAS降低、DLAT寡聚升高，说明Cu²⁺进入线粒体扰乱TCA循环并触发铜死亡，Ca²⁺/H₂O₂加剧线粒体离子稳态紊乱和氧化应激。

2.6 焦亡诱导：通过明场、Bio-TEM、免疫荧光、WB、LDH和IL-1β检测，发现细胞肿胀、膜孔形成和破裂，GSDMD-N和Cleaved Caspase-1升高，IL-1β和LDH释放最高，说明CaO₂/CZ/GOX经Caspase-1依赖性焦亡通路杀死Hepa1-6细胞并释放促炎因子。

2.7 ICD：通过CRT和HMGB1免疫荧光及定量，发现CRT膜暴露增强、HMGB1核信号减弱，说明DAMPs释放和表面转位，触发“焦亡-ICD-T细胞激活”级联。

2.8 生物安全性评价：通过H&E、血液学、肝肾功能和溶血实验，发现主要器官无病理改变，ALT、AST、UREA、CREA正常，溶血率低于5%，说明体内生物相容性良好。

2.9 体内荧光成像：通过荧光标记NPs注射后成像和定量，发现肿瘤荧光12 h达峰并持续至72 h，72 h肿瘤信号高于主要器官，说明EPR效应介导肿瘤靶向蓄积和快速系统清除。

2.10 体内抗肿瘤治疗：通过Hepa1-6荷瘤小鼠随机分组治疗、体重、瘤体积、离体瘤和H&E，发现CaO₂/CZ/GOX显著减小瘤体积、体重无显著变化、肿瘤组织碎裂和核溶解最明显，说明强抗肿瘤疗效且系统毒性低。

2.11 增强体内免疫应答：通过肿瘤组织FDX1、Cleaved Caspase-1、HMGB1免疫荧光，流式检测CD4⁺/CD8⁺ T细胞和DC成熟，ELISA检测IL-6/TNF-α，发现FDX1降低、Cleaved Caspase-1升高、HMGB1降低，肿瘤和脾CD8⁺/CD4⁺ T细胞及DC成熟增加，血清IL-6/TNF-α升高，说明铜死亡-焦亡级联增强免疫原性并激活系统抗肿瘤免疫。

2.12 抑制肿瘤复发：通过肿瘤再挑战模型、离体瘤和流式检测脾CD44⁺CD62L^-CD8⁺效应记忆T细胞，发现再挑战肿瘤生长显著抑制、几乎无复发瘤，记忆T细胞增加，说明诱导长期抗肿瘤免疫记忆抵抗再挑战。

讨论部分总结：该研究强调多路径协同。CaO₂/CZ/GOX利用酸性TME和CZ载体，CaO₂与GOX级联产生H₂O₂，Cu²⁺参与类芬顿反应产生·OH并触发FDX1介导的铜死亡；铜死亡和钙/离子稳态紊乱加重线粒体损伤，放大Caspase-1/GSDMD焦亡；焦亡释放DAMPs和炎性因子，促进DC成熟和T细胞浸润，形成从局部肿瘤死亡到系统性免疫的级联。体内外结果共同显示耗糖、肿瘤蓄积、生物相容性、抑瘤、抗复发和免疫记忆。其意义在于整合代谢干预、氧化损伤、铜死亡、焦亡和免疫激活，为肿瘤代谢调控和免疫微环境重塑提供新策略。

研究结论翻译：总之，研究人员成功设计并合成了CaO₂/CZ/GOX NPs，其通过葡萄糖消耗、离子稳态失调和铜死亡协同加剧线粒体氧化应激，从而放大肿瘤焦亡。该级联反应触发ICD，进而促进抗肿瘤免疫激活。体内实验显示显著的肿瘤抑制且全身毒性可忽略。该纳米系统具有良好的生物安全性、肿瘤靶向能力和强效抗肿瘤疗效。总体而言，CaO₂/CZ/GOX NPs是一种安全有效的级联纳米系统，为肿瘤免疫治疗策略的开发提供了实验证据。