MUC13基因p.Arg503Ser变异增强肠道三价铁吸收导致不明原因高铁蛋白血症的机制研究

《LIVER INTERNATIONAL》：A MUC13 Variant Enhances Intestinal Ferric Iron Absorption in Unexplained Hyperferritinemia

　　

摘要 背景与目的：高铁蛋白血症（hyperferritinemia）尽管经过全面评估，仍常常无法明确病因。研究人员开展了一项基于测序的外显子组关联研究，旨在鉴定不明原因高铁蛋白血症患者中与血浆铁蛋白水平相关的遗传变异。 方法：采用结合多元与合并法（combined multivariate and collapsing method, CMC）及贝叶斯推断（Bayesian inference）进行基于基因的关联检验，研究对象为因临床外显子组测序（clinical exome sequencing, CES）而转诊的患者（n=392），在排除了已知的高铁蛋白血症病因后进行分析。研究结果在一个独立的验证队列（n=263）中得到确认。功能研究包括Muc13基因敲除小鼠、肠道细胞模型、蛋白质组学分析和定点诱变。 结果：MUC13 p.Arg503Ser变异在纯合状态下显示出极强贝叶斯证据，表明其与血浆铁蛋白、铁和转铁蛋白饱和度升高相关联。在验证队列中，纯合503Ser基因型是转铁蛋白饱和度升高的最强独立预测因子（比值比，4.52；95%置信区间，1.55–13.19；p=0.006）。相反，Muc13基因敲除小鼠表现出较低的血浆铁和转铁蛋白饱和度，这与MUC13在肠道铁吸收中的作用一致。在人肠道细胞中，MUC13敲低减少三价铁摄取，而MUC13过表达则增加三价铁摄取。蛋白质组学分析鉴定出整合素α6（integrin alpha 6, ITGA6）和整合素β4（integrin beta 4, ITGB4）为MUC13相关候选蛋白。表达纯合503Ser变异的细胞在铁暴露后表现出更高的细胞表面MUC13表达水平，以及铁蛋白重链1（ferritin heavy chain 1, FTH1）、钙网蛋白（calreticulin, CALR）和核因子红系2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2, NRF2）水平的升高。 结论：这些发现支持MUC13在肠道三价铁吸收中的作用，以及MUC13纯合503Ser基因型与增强的细胞铁摄取之间的因果联系，这可能有助于更好地理解不明原因的高铁蛋白血症。

论文解读：MUC13基因p.Arg503Ser变异在不明原因高铁蛋白血症中的致病机制

一、研究背景与科学问题

高铁蛋白血症（hyperferritinemia）在临床实践中十分常见，通常由炎症反应等继发性因素或HFE基因突变等遗传性血色病引起。然而，仍有相当比例的患者在排除已知的非遗传性和遗传性病因后，其高铁蛋白血症的原因仍然不明，提示可能存在尚未被鉴定的遗传因素。既往的全基因组关联研究（genome-wide association study, GWAS）多在普通人群中进行，未能有效排除具有明确继发原因的个体，可能稀释了遗传信号；同时，GWAS主要检测常见变异，对效应量较大的罕见编码变异覆盖不足。此前尚无基于测序的外显子组关联研究针对经过严格临床表征的不明原因高铁蛋白血症人群，探索编码区遗传变异对血浆铁蛋白水平的贡献。因此，研究人员开展本研究，旨在通过测序手段发现新的致病基因变异。

二、研究方法概述

研究人员首先从法国南锡大学医院基因组医学部转诊进行临床外显子组测序（clinical exome sequencing, CES）的成人患者中筛选出392例符合条件者作为发现队列，通过严格的排除标准（如肝细胞溶解、炎症综合征、慢性肾病、输血史、铁剂治疗史等）剔除已知病因，最终纳入483次就诊记录。采用结合多元与合并法（combined multivariate and collapsing method, CMC）和线性回归进行基因层面的关联检验，并以贝叶斯方差分析（Bayesian analysis of variance, ANOVA）验证显著变异。随后在来自法兰西岛地区三家大学医院的263例不明原因高铁蛋白血症患者组成的独立验证队列中进行重复验证。功能研究方面，研究人员利用Muc13基因敲除（knockout, KO）小鼠模型、人LS513和SW480肠道上皮细胞系的敲低与过表达实验、免疫共沉淀（co-immunoprecipitation, Co-IP）、液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS）蛋白质组学分析以及定点诱变（site-directed mutagenesis）技术，系统探究MUC13在铁代谢中的作用。

三、研究结果

3.1 患者选择与数据集概况：在392例患者（1306次就诊）中，经排除标准筛选后保留483次就诊。中位血浆铁蛋白为120 μg/L，转铁蛋白饱和度为26%。基因组数据集包含316811个变异，经质控和过滤后，45575个非单态变异进入分析。

3.2 外显子组关联研究鉴定出与血浆铁蛋白水平相关的基因：基因层面CMC回归分析经协变量校正后，鉴定出107个与铁蛋白水平显著关联的基因（Bonferroni校正后）。在这些基因中，193个最小等位基因频率（minor allele frequency, MAF）>1%的变异经逐变异线性回归分析，有31个达到Bonferroni显著性水平。

3.3 贝叶斯分析证实MUC13 p.Arg503Ser变异与铁状态参数的强关联：贝叶斯方差分析进一步验证了31个变异中的11个，其中4个显示出极强证据（贝叶斯因子BF[m]>100）：MUC13、ZNF644、TBL1XR1和TRIM37。MUC13错义变异（p.Arg503Ser）与血浆铁蛋白的关联最强（BF[m]=5.26×10¹⁹），纯合Ser/Ser基因型携带者的平均铁蛋白达782 μg/L，远高于Arg/Arg型的185 μg/L和Arg/Ser型的203 μg/L。在11个交叉验证的变异中，仅MUC13 p.Arg503Ser与血浆铁和转铁蛋白饱和度也显示出极强贝叶斯证据，且与体重指数、丙氨酸氨基转移酶和C反应蛋白均无关联，排除了代谢综合征、肝细胞溶解或炎症的混杂影响。

3.4 独立验证队列确认MUC13 p.Arg503Ser Ser/Ser基因型富集于转铁蛋白饱和度升高的患者：验证队列中，Ser/Ser基因型频率（10.6%）显著高于gnomAD欧洲非芬兰参考人群（6.5%，相对风险RR=1.63，p=0.018）。在转铁蛋白饱和度>55%的患者中，Ser/Ser携带者比例为15.2%，而≤55%组仅为4.3%。多变量逻辑回归显示，MUC13 503Ser/Ser基因型是转铁蛋白饱和度升高（>55%）的最强独立预测因子（比值比OR=4.52，95%置信区间CI 1.55–13.19，p=0.006）。

3.5 Muc13^?/?小鼠表现出血浆铁和转铁蛋白饱和度降低：与野生型相比，Muc13敲除小鼠的血浆铁（17.2 vs. 22.2 μmol/L，p=0.03）和转铁蛋白饱和度（15.9% vs. 22.1%，p=0.02）显著降低，而转铁蛋白、铁蛋白和铁调素（hepcidin）水平无统计学差异，但半数敲除小鼠的铁调素水平极低。肝脏铁含量和组织学染色两组间无差异，提示MUC13主要在肠道水平调节铁吸收。

3.6 MUC13调控铁代谢相关蛋白FTH1、CALR和NRF2：在Muc13敲除小鼠十二指肠上皮细胞中，铁蛋白重链1（ferritin heavy chain 1, FTH1）、钙网蛋白/移动铁蛋白（calreticulin/mobilferrin, CALR）和核因子红系2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2, NRF2）水平均显著低于野生型。在人LS513细胞中，MUC13敲低使上述三种蛋白下降；而在SW480细胞中，MUC13过表达则使其升高。

3.7 MUC13与整合素家族蛋白ITGA6和ITGB4相互作用：免疫共沉淀未发现MUC13与CALR的直接物理互作。无偏倚的质谱免疫沉淀蛋白质组学分析在MUC13过表达细胞中鉴定出37个高可信度候选蛋白，其中整合素α6（integrin alpha 6, ITGA6）和整合素β4（integrin beta 4, ITGB4）所在的整合素信号通路富集程度最高（z评分3.545，p=4.17×10^?11），二者分别上调约46倍和38倍。

3.8 MUC13促进人肠道细胞的三价铁摄取：铁处理剂量依赖性地增加细胞内FTH1水平，且MUC13高表达细胞的增幅更大。MUC13敲低显著减少LS513细胞的铁摄取，而上清液铁浓度升高；MUC13过表达则增加SW480细胞的铁摄取，上清液铁浓度降低。

3.9 MUC13敲低保护细胞免受三价铁毒性：铁蔗糖（320 μg/mL）显著抑制对照LS513细胞的增殖，但对MUC13 siRNA处理的细胞无此作用；反之，MUC13过表达加剧了铁诱导的SW480细胞生长抑制。

3.10 MUC13 503Ser/Ser变异增加细胞表面MUC13表达和铁摄取：流式细胞术显示，表达503Ser/Ser变异的SW480细胞表面MUC13水平显著高于野生型（503Arg/Arg）细胞，而总MUC13水平无差异。铁暴露后，503Ser/Ser细胞的FTH1、CALR和NRF2水平均显著高于野生型细胞，而转铁蛋白受体（transferrin receptor, TFRC）无变化。

四、讨论与结论

本研究的讨论部分指出，MUC13 p.Arg503Ser变异与不明原因高铁蛋白血症患者的血浆铁蛋白和转铁蛋白饱和度升高显著关联，并在独立验证队列中得到重复，503Ser/Ser基因型成为转铁蛋白饱和度升高的最强独立预测因子。功能研究将MUC13定位于肠道三价铁（Fe³⁺）吸收途径，并通过定点诱变证实该变异可导致细胞表面MUC13表达增加和铁摄取增强。MUC13是一种在胃肠道高度表达的跨膜黏蛋白糖蛋白，构成肠上皮细胞微绒毛表面的糖萼，其硫酸基和羧基可通过形成胶体多羟基铁核螯合Fe³⁺，维持其在生理pH下的可溶性，随后Fe³⁺经由整合素-钙网蛋白/移动铁蛋白（mucin-integrin-calreticulin/mobilferrin）途径进入肠上皮细胞。本研究首次鉴定出MUC13是该途径中此前未知的黏蛋白组分。蛋白质组学发现ITGA6和ITGB4为MUC13相关蛋白，为这一机制提供了分子证据。p.Arg503Ser位于MUC13胞质结构域，生物信息学预测该变异可能引入一个新的磷酸化位点，从而影响信号转导和细胞表面稳定性。研究的局限性包括：发现队列为转诊人群、需在不同种族人群中进一步验证、未评估其他MUC13变异的作用、未直接证明MUC13与CALR的物理互作、未测试ITGA6/ITGB4是否介导MUC13依赖性铁摄取、未定量比较不同基因型的磷酸化水平等。

研究结论：本研究提供了新的证据，支持MUC13参与肠道三价铁摄取，并确立了MUC13纯合503Ser基因型与增强的细胞铁吸收之间的因果关系，这有助于更好地理解不明原因高铁蛋白血症的发病机制。