超越经典耗竭：组织指令性T细胞功能障碍中的RNA调控层

《European Journal of Immunology》：Beyond Exhaustion: The RNA Regulatory Layer of Tissue-Instructed T Cell Dysfunction

　　

CD8⁺ T细胞耗竭（T cell exhaustion）是由持续性抗原刺激驱动的分化程序，并通过转录因子网络和染色质等多重调控层得以稳定。除这些已确立的框架外，RNA调控层正逐渐成为耗竭T细胞身份的又一决定因素，其涵盖非编码RNA（noncoding RNAs, ncRNAs）、RNA结合蛋白（RNA-binding proteins, RBPs）、可变剪接异构体和表观转录组修饰（epitranscriptomic modifications）。在此背景下，逆转录转座子来源转录本仍 largely 未被充分探索，例外是含LINE1的转录本，后者与耗竭存在因果联系并可直接作为治疗靶点。然而，该RNA层是耗竭的可推广特征，还是由抗原致敏（antigen priming）所发生的组织所指令，仍不清楚。目前多数认识来自初始CD8⁺ T细胞由次级淋巴器官中的专业抗原提呈细胞（antigen-presenting cells, APCs）致敏的实验设置。然而，在肝脏中，肝细胞可直接致敏初始CD8⁺ T细胞，产生一种低功能状态，其在转录和药理学上不同于经典耗竭，对检查点阻断（checkpoint blockade）难治，但可被4-1BB激动（4-1BB agonism）逆转。研究人员提出，RNA调控层是组织来源信号得以编码的可能底物，且肝脏为定义和治疗性靶向组织指令性T细胞功能障碍提供了有力模型。

1 引言
T细胞耗竭最初被描述为慢性感染过程中抗病毒效应功能的进行性丧失，现被视为一种独特的分化程序，以抑制性受体持续表达、代谢重塑以及区别于效应和记忆群体的转录与表观遗传架构为特征。既有框架主要建立在慢性淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）感染或移植瘤模型中初始CD8⁺ T细胞由次级淋巴器官专业APCs致敏的狭窄实验配置内，其能否解释不同组织和疾病中的低功能状态尚未完全确立。文章提出两个相关问题：其一，哪些机制建立、维持和逆转耗竭状态；除转录因子和染色质回路外，RNA介导的调控（ncRNAs、RBPs、可变剪接异构体和表观转录组修饰）可多样化基因表达输出，但许多RNA种类逃逸常规转录组检测，其作用于RNA稳定性、定位和翻译的机制亦难以显现。其二，抗原遭遇所在组织如何塑造T细胞低功能；肝脏作为非专业细胞致敏产生偏离经典耗竭轨迹的范例，有助于改进检查点或共刺激干预的选择，并揭示可恢复T细胞功能的细胞内RNA靶点。

2 T细胞耗竭是确定的分化程序
耗竭CD8⁺ T细胞通过协调程序重塑效应功能、代谢和细胞身份，表现为持续性组合抑制性受体表达、细胞因子产生的层级性丢失（IL-2最先丢失，继而TNF，最后IFN-γ）、增殖能力下降和线粒体适应改变，以及区别于效应或记忆细胞的转录和表观遗传配置。该群体具有异质性和发育顺序：T细胞因子1（TCF1）⁺ SLAMF6⁺祖细胞亚群保留自我更新、维持反应，并在PD-1阻断后提供增殖爆发，进而产生中间效应样状态和最终TOX高表达、组织限制、短寿命的终末耗竭细胞；进展总体单向，再激活能力沿此下降。转录回路方面，持续TCR信号和不受AP-1平衡的NFAT活性驱动TOX和NR4A表达，TOX对耗竭核心特征必要且充分；NFATc1与IRF4和BATF维持抑制性受体表达和存活。TCF1维持祖细胞区室可塑性，但细胞向中间状态转变后该能力丧失；STAT5使细胞偏向持久效应样状态。KLF2通过S1PR1和CD62L维持再循环，KLF3促进驻留；环境传感器IRF2、NFAT5和ATF4分别偶联持续干扰素、高渗应激以及缺氧和营养限制。

3 T细胞耗竭的表观遗传控制
持续抗原暴露和组织特异条件产生的环境线索汇聚于T细胞表观基因组，最初由转录因子网络解读，进而重塑染色质可及性和增强子使用，方式不同于效应和记忆T细胞。DNA甲基化、组蛋白修饰、ATP依赖性染色质重塑和高级基因组组织进一步调控效应、祖细胞和耗竭状态间转换。TET2依赖性去甲基化控制活化细胞早期分叉和终末耗竭进展；SUV39H1介导的H3K9三甲基化限制记忆相关和干样程序并强化抗PD-1表型，LSD1则拮抗以TCF1为中心的祖细胞维持。染色质重塑复合物作用相反：经典BAF为耗竭相关可及性所需，PBAF限制效应样扩增；乙酰辅酶A代谢改变可重塑组蛋白乙酰化并偏向效应记忆或耗竭相关基因程序；高级基因组组织通过染色质枢纽和CTCF依赖性相互作用维持耗竭。这些机制解释耗竭的建立和表观遗传稳定性，但是否有其他调控层参与维持仍 largely 未解决。

4 超越转录：T细胞耗竭的RNA调控层
RNA不仅是转录下游产物，调控RNA、RBPs、剪接异构体和化学RNA修饰可反馈影响表观调控、转录本加工、稳定性和翻译，主动贡献细胞身份。微小RNA（microRNAs）提供慢性刺激下RNA介导控制的最早证据之一：慢性LCMV感染中miR-31增强对持续I型干扰素信号的敏感性，miR-155支持T细胞持久性并与PHF19共同限制终末分化；肿瘤模型中let-7限制PI3K-AKT-mTOR依赖性代谢重编程。长非编码RNA可作为支架、引导物和诱饵，如lnc-Tim3结合TIM-3并改变BAT3定位，从而加剧肝细胞癌中的耗竭；NKILA由TCR驱动钙信号诱导并抑制NF-κB，使肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞凋亡。RNA调控亦可跨细胞发生：肿瘤来源细胞外囊泡将circUSP7和circCCAR1转移至淋巴细胞，前者通过隔离miR-934升高SHP2，后者稳定PD-1，均损害抗肿瘤活性和PD-1阻断反应。RBPs控制转录本加工、稳定和翻译，并与TCR信号强度和共刺激偶联：TRA2β通过TCR敏感的自调控剪接调节丰度并控制TCR信号和效应功能相关转录本加工；PTBP1支持CD8⁺ T细胞活化并促进c-Fos、NFATc2和NFATc3核积累；ZFP36L1将TCR亲和力与细胞因子感知连接，ZFP36和ZFP36L1强化对CD28共刺激的依赖，其缺失加速分化并增强细胞毒性。LARP4在T细胞获得耗竭相关特征时诱导，选择性增强核编码氧化磷酸化（OXPHOS）转录本翻译，破坏线粒体化学计量，其缺失限制终末耗竭并改善抗肿瘤活性。表观转录组修饰增加另一层调控：m⁶A参与T细胞稳态、TCR信号和存活，m⁶A阅读蛋白YTHDF2支持肿瘤浸润CD8⁺ T细胞的效应转录程序和线粒体适应；METTL3/METTL14缺失稳定IFN-γ–STAT1–IRF1信号并增加细胞毒性CD8⁺ T细胞浸润；PCBP1维持效应程序并限制抑制性检查点上调；NAT10介导的ac⁴C修饰促进MYC翻译以支持T细胞扩增。总体而言，RNA介导调控可主动塑造T细胞功能和命运，但其对耗竭建立和维持的因果贡献仍有限，尤其对逃逸常规转录注释的RNA种类；逆转录转座子来源序列构成 largely 被忽视的调控区室，RBPs与逆转录转座子来源转录本的相互作用可能是未探索维度，PTBP1为T细胞中的示例。

5 逆转录转座子RNA：从基因组重复序列到T细胞状态调控者
逆转录转座元件（REs）约占人类基因组43%，通过RNA中间体传播，包括LTR元件（含内源性逆转录病毒）和非LTR元件。多数拷贝不再移动，但其序列仍具转录活性，并被征用为调控元件和剪接位点，亦以细胞类型和情境特异方式并入宿主基因转录本，产生具有转录和染色质组织功能的替代异构体和非编码RNA。癌症中RE再激活主要在肿瘤细胞中研究，RE来源双链RNA激活天然感应和I型干扰素反应，RE来源肽可作为肿瘤抗原；T细胞中含RE RNA所知甚少。小鼠模型中，内源性逆转录病毒样VL30转录本富集于祖耗竭CD8⁺ T细胞，随终末分化下降，并在检查点阻断后再表达，提示RE转录可标记T细胞状态；LINE1位点Lx9产生ncRNA Lx9c11-RegoS，通过Schlafen基因限制抗病毒活化。初始CD4⁺ T细胞中LINE1序列并入非经典非编码异构体，积累于染色质并限制活化相关基因表达；活化后这些转录本经mTORC1依赖性机制下调，其中PTBP1抑制非经典LINE1转录本剪接，并伴随相应经典异构体转录延伸的协调变化。耗竭T细胞中其异常积累导致功能受损，而反义寡核苷酸（ASOs）可恢复细胞因子产生和细胞毒性活性。LINE1转录本亦随年龄在记忆T细胞中积累，限制细胞周期进展和蛋白合成。这些发现确立含LINE1转录本为T细胞功能障碍的因果且可治疗调控因子，并提出RE来源RNA程序在不同功能障碍状态中是否共享或不同、是否受功能障碍发生组织环境塑造的更广泛问题。

6 超越经典实验设置
迄今总结几乎均来自狭窄实验配置：慢性LCMV感染或移植瘤模型中，近交小鼠次级淋巴器官专业APCs致敏初始CD8⁺ T细胞。该配置固定了患者中并非恒定的变量，包括哪种细胞首先递呈抗原、反应发生组织及T细胞在其中位置，以及所得状态是否对相同治疗干预敏感；亦施加了细胞先获得效应功能、随后才丢失的特定轨迹。该轨迹并非普遍：原发肿瘤模型中肿瘤特异性CD8⁺ T细胞早期即低反应，不经过功能性效应期，该状态初期可塑后逐渐固定；早期和晚期功能障碍细胞具有不同染色质可及性模式，均不同于初始、效应和记忆细胞。无炎症或CD4⁺ T细胞帮助时遭遇抗原可产生无能和周围耐受，其为稳定印记程序，与耗竭共享分子特征但诱导方式不同，并非耗竭的较轻版本。无AP-1伙伴的NFAT活化驱动不同于效应分化的程序，为致敏时点分叉提供机制基础。组织本身是第二变量：器官在抑制性细胞因子、代谢物和氧可用性、基质结构及无害抗原持续暴露方面不同；外周器官限制效应活性可被解读为疾病耐受而非免疫失败，以病毒持续和肿瘤进展为代价限制免疫病理。组织内位置是第三变量：干细胞样TCF1⁺细胞积累于肿瘤引流淋巴结、三级淋巴结构和瘤内微环境，终末分化细胞则主要见于其他部位；空间转录组已将重复细胞邻域与特定T细胞状态联系。多数因果实验操纵细胞类型或可溶介质而非组织结构，因而确定所需信号而非位置本身是否指令命运；淋巴器官中位置具指导性，但非淋巴器官中是否类似尚未测试。RNA调控机制亦可能贡献淋巴细胞定位：RBPs表达于淋巴细胞及抗原提呈和实质细胞；抗体分泌细胞中ZFP36L1通过调节GRK2、α4-整合素和β1-整合素mRNA促进脾至骨髓归巢，其缺失损害对鞘氨醇-1-磷酸的迁移。类似RBP或ncRNA依赖性机制是否调控T细胞迁移和组织驻留并贡献耗竭仍 largely 未探索。最后，组织指令性功能障碍状态是否保留与经典耗竭相同的治疗敏感性亦为重要挑战。

7 肝脏：独特的功能障碍T细胞状态
肝脏为定义此类组织指令状态并治疗性利用提供理想环境。其持续暴露于肠源抗原，血管和细胞结构偏向耐受：有孔不连续窦内皮以低压灌注，使循环淋巴细胞可跨Disse间隙直接接触肝细胞；抗原提呈分布于多种非传统细胞类型，肝细胞沿稳定门-中央代谢梯度排列，在一个器官内产生不同微环境。在此环境中，初始CD8⁺ T细胞可直接由肝细胞致敏。肝细胞致敏触发活化和增殖但不触发效应分化，启动独特程序，使细胞从反应最早阶段即功能受损。所得状态在三个方面不同于经典耗竭：组成上，长期抗原暴露产生长寿、自我更新、异质的细胞池，包括一个功能障碍干样亚群和两个功能障碍终末记忆亚群，具有明确层级且无慢性LCMV感染中出现的效应样区室；转录组上，驻留亚群与终末耗竭细胞共享核心签名，包括Tox和Pdcd1，但表达独特基因集，终末耗竭签名仅弱富集；药理学上，PD-1、LAG-3或CTLA-4阻断效果极小，而4-1BB激动将这些细胞转化为可清除抗原表达肝细胞的抗病毒效应器，且HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞中重现相同层级。HBV特异性CD8⁺ T细胞显示严重线粒体和代谢功能障碍，贡献其受损抗病毒活性，并可被线粒体靶向抗氧化剂体外部分纠正；这些代谢异常究竟反映肝环境中经典耗竭还是独特组织指令功能障碍状态仍未解决。该肝性功能障碍程序的分子基础亦未解决：转录因子和染色质研究迄今在各模型中返回 largely 相同网络，仅转录谱可能不可靠，因为功能障碍T细胞可含丰富细胞因子和细胞毒性mRNA但相应蛋白很少，差异归因于转录后和翻译控制。RNA调控层因此既可能是组织特异信息的位点，又是常规谱分析会遗漏的层面，但其对组织指令性CD8⁺ T细胞功能障碍的贡献尚未被研究。

8 研究并靶向组织指令性T细胞命运的范例环境
肝脏对此问题尤为适合，原因有二。实验上，门-中央分区创建解剖和代谢不同的微环境，同时保留共同血管供应、抗原来源和T细胞库，使位置和代谢变量可与内部对照比较；抗原由确定的非专业细胞类型而非异质群体递呈；所得状态在慢性乙型肝炎及可能原发和转移性肝癌患者中有直接对应，实验定义机制可对人疾病检验。解析该环境中的RNA层仍需常规流程缺乏的方法：长读测序重建非经典异构体，染色质组分RNA测序捕获染色质滞留转录本，重复感知定量，并结合功能扰动和足以将转录程序与小叶内位置联系的空间分辨。治疗上，当前免疫治疗作用于细胞表面受体，而维持功能障碍的细胞内程序 largely 不可及；其持续可能限制检查点介导再激活的幅度和持久性，促成免疫治疗抵抗。序列引导分子改变此局面：ASOs、小干扰RNA（siRNAs）和剪接转换寡核苷酸作用于编码和非编码转录本、单个异构体及含重复RNA，均为抗体或传统小分子不可及。含LINE1转录本提供原理证明，靶向维持功能障碍的RNA程序可直接恢复T细胞功能或使反应不佳细胞对检查点阻断敏感；剪接转换至功能不同的PD-1异构体将策略扩展至经典检查点；脂质纳米颗粒（LNPs）进一步拓宽，因为同一平台可递送mRNA表达载荷或ASO清除特定转录本。肝脏再次有利：其窦状结构和直接暴露于循环试剂驱动寡核苷酸和LNPs在肝内积累，且肝递送临床验证平台已存在。肝趋向不等于对肝内T细胞的有效递送，多数制剂优先积累于肝细胞和其他驻留群体；到达功能障碍淋巴细胞需要细胞选择性摄取、内体逃逸和足够胞内驻留，抗体靶向LNPs、抗体-寡核苷酸偶联物和受体导向化学为当前候选。RNA靶点另有两点障碍：因果调节因子必须通过功能扰动而非相关性识别，因为许多RNA追踪活化状态却不贡献其中；选择性靶向技术困难，近缘LINE1拷贝混淆功能转录本，异构体导向策略依赖维持功能障碍状态变异的准确注释。

9 结论与未来展望
耗竭在转录和表观遗传层面已有明确定义，这解释其大部分稳定性，但并非所有抗逆转特性，且其推导条件排除了患者中可能重要的若干变量。研究人员认为RNA调控层是缺失调控的可能位点，逆转录转座子来源转录本是其最少探索的组分，含LINE1 RNA已提供因果且可治疗原理证明。由此产生三个问题：非专业组织驻留抗原提呈产生的低功能CD8⁺ T细胞是否携带可分离于经典耗竭的程序，以及该程序是否跨物种和疾病保守，尚未解决；对重复衍生组分，保守性须按共享调控功能而非保守序列评估。RNA层是否像对经典耗竭那样对组织指令状态有因果贡献尚不清楚，哪些上游调节因子执行这些程序亦未知。结构化器官内位置是否像淋巴器官中约束选择和生发中心命运那样约束T细胞分化，尚未在解剖允许清晰答案处测试。肝脏使三者均可被研究并独特偶联治疗路径：非专业细胞类型致敏在该处记录最充分，所得功能障碍在药理学上已不同于耗竭，内部梯度允许受控比较，RNA导向剂可高效到达器官。回答这些问题将确定维持功能障碍的程序是一个还是多个，以及能否靶向这些程序以恢复T细胞功能或使反应不佳细胞对检查点阻断敏感。