RAS–BRAF结合动力学特征揭示异构体选择性、致癌性信号放大及突变依赖性抑制剂耐药

《The FEBS Journal》：Kinetic signatures of RAS–BRAF engagement reveal isoform selectivity, oncogenic amplification, and mutation-dependent inhibitor resistance

　　

RAS–RAF–MEK–ERK（促分裂原活化蛋白激酶，MAPK）信号级联是细胞增殖与分化的核心调控通路，其失调是肿瘤发生的常见驱动因素。RAF激活需要GTP结合型RAS在质膜处募集；然而，调控RAS–RAF结合的确切分子决定因素仍未被完全阐明。本研究表明，BRAF N端区域形成协同性BSR–CRD自抑制门控，限制RAS结合并编码异构体特异性动力学行为。研究人员利用开放式表面等离子体共振（OpenSPR）和生物层干涉术（BLI），并结合NanoBiT细胞分析，揭示了一种动力学编码机制，其中KRAS和NRAS界定BRAF结合的不同模式：KRAS表现为稳定性驱动、长寿命复合物形成，而NRAS表现为频率驱动、瞬时相互作用。致癌突变通过选择性稳定RAS–BRAF结合而非一致增加亲和力来重塑这些模式，放大异构体特异性动力学特征。药理学分析进一步揭示，RAS–RAF破坏的异构体依赖性敏感性受核苷酸状态及与BSR–CRD门控兼容性调控。综上，这些发现确立KRAS和NRAS通过不同BRAF结合动力学模式发挥作用，该模式受结构门控的N端调控架构支配，并在MAPK信号中编码时间与药理学特异性。

研究背景与问题：RAS（rat sarcoma）–RAF（rapidly accelerated fibrosarcoma）–MEK–ERK（MAPK）级联是细胞增殖、分化与存活的核心调控通路，其失调常驱动肿瘤发生。RAF活化需GTP（guanosine triphosphate，鸟苷三磷酸）结合型RAS在质膜募集；BRAF N端含RBD（RAS-binding domain，RAS结合结构域）、CRD（cysteine-rich domain，富半胱氨酸结构域）及BRAF特有BSR（BRAF-specific region，BRAF特异性区域），但RAS–RAF结合的精确分子决定仍不完全清楚。原文指出尚不明确致癌RAS突变如何改变BRAF N端调控构象（超出经典RBD界面）；NRAS是黑色素瘤和血液肿瘤的重要驱动因素且与第一代BRAF抑制剂获得性耐药相关，但研究相对不足；RAS靶向抑制剂对RAS–RAF复合形成、结合动力学、异构体依赖性和突变特异性的直接影响亦未充分表征。因此，研究人员整合生物物理与细胞方法，系统解析不同致癌状态及药理干预如何调节RAS–RAF组装。

关键技术方法：研究人员制备BRAF N端截短体NT1（BSR–RBD–CRD）至NT4（RBD）及NT5（仅CRD），以及RAS野生型和突变体，采用开放式表面等离子体共振（OpenSPR）与生物层干涉术（BLI）测定结合动力学，GST pull-down验证结合；以NanoBiT（LgBiT/SmBiT发光互补）在HEK293细胞中定量RAS–BRAF相互作用并评估抑制剂。HEK293细胞系（RRID:CVCL_0045）原始购自ATCC（cat#CRL-1573）。

研究结果：NRAS以相对于KRAS和HRAS居中的亲和力结合BRAF N端结构域。OpenSPR显示NRAS与NT1结合较弱（K_D=587±52.32 nM），去除CRD的NT2增强至85±12.7 nM，NT3为60.3±9.47 nM，NT4为93.45±20.57 nM，NT5无可检测结合；pull-down与之一致，提示RBD为主要决定因素，完整BSR–RBD–CRD对NRAS结合具有负调控。NRAS第61位密码子突变增强与BRAF N端相互作用。OpenSPR显示Q61L/Q61R的K_D为87/91 nM（约7倍增强），Q61K/G12D为116/116 nM（约5倍增强），主要由k_on升高驱动而k_off相近；pull-down显示GDP型结合弱，GMPPNP型及突变体结合强；Q61R对NT2增强、对NT3基本保留、对NT4降低。致癌KRAS突变显著增强与BRAF N端结合。OpenSPR显示WT KRAS的K_D为267±9.8 nM，G13D、Q61L、Q61R分别约11、13、7倍增强，G12D仅轻度增强；pull-down中G13D/Q61H/Q61R/Q61L增强而G12D/G12V与WT相似；KRAS突变体解离更慢（约2.7–7.0×10^?4 s^?1），较NRAS突变体（约3.3–4.0×10^?3 s^?1）形成更稳定复合物。RAS突变重塑细胞中BRAF结合及抑制剂敏感性。NanoBiT在HEK293中证实NRAS Q61L/K–BRAF与KRAS G13D/Q61R–BRAF相互作用增强；WT NRAS–BRAF中RMC-6236抑制最强，NRAS Q61L/Q61K中RMC-6236仍强效而BI-2865无显著作用；WT KRAS–BRAF中adagrasib与RMC-6236作用明显，KRAS Q61R对sotorasib和BI-2865完全耐药、adagrasib抑制减弱而RMC-6236仍约64%抑制，提示G13/Q61热点增强BRAF招募并形成等位基因特异性switch-II口袋抑制剂屏障。在Adagrasib和BI-2865存在下KRAS与NRAS–BRAF NT1相互作用的BLI分析。BLI测得NRAS与KRAS的K_D分别为659±68.59 nM和210±33.94 nM，与OpenSPR一致；adagrasib使KRAS–BRAF NT1亲和力约降低120倍、NRAS约降低2.7倍，BI-2865使KRAS约降低6.8倍、NRAS约降低1.8倍，表明adagrasib呈异构体依赖的强破坏作用，BI-2865作用较温和且跨两异构体较均匀。

讨论与结论：讨论部分提出BRAF N端BSR–CRD构成自抑制门控，限制RAS接近RBD；去除BSR或CRD可部分解除限制。NRAS以亚微摩尔亲和力结合，体现BRAF结合层级KRAS>NRAS?HRAS；BSR为BRAF特有，构成额外调控层和潜在脆弱点。致癌突变主要增强与完整N端组装结合，Q61R效应依赖BRAF N端结构背景；KRAS复合物解离更慢，NRAS更动态。抑制剂方面，RMC-6236跨KRAS/NRAS及Q61突变较一致；adagrasib对KRAS更强、对NRAS弱，与switch-II口袋结构差异相符；Q61突变稳定活性GTP结合构象并降低switch-II口袋可及性，BI-2865倾向GDP结合构象。研究结论翻译：综上，研究人员的发现支持一种模型，其中BRAF N端调控区作为构象门控调节RAS结合，而内在的异构体特异性动力学性质和致癌突变决定该门控被克服的效率与稳定性。在此框架内，致癌RAS突变通过促进更高效、更持久的BRAF募集增强信号输出，而药理抑制剂依据异构体特异性结构特征和构象状态偏好差异性地破坏这些相互作用。这些结果为RAS–RAF相互作用的动态调控提供机制见解，并突出突变依赖性结合动力学变化可能如何促成RAS驱动癌症中不同的治疗反应。