视紫红质样与促胰液素样GPCR–arrestin相互作用及调控的结构与功能机制解析

《The FEBS Journal》：Structural and functional insights into rhodopsin-like and secretin-like GPCR–arrestin interactions and regulation

对arrestin的结构与功能研究已揭示其作为G蛋白偶联受体（GPCR）信号、脱敏和运输的多功能调节者的重要作用。尽管捕获GPCR–arrestin相互作用的动态性质仍存在显著挑战，近年来已取得重要进展，尤其是通过冷冻电镜（cryo-EM）和X射线晶体学（X-ray crystallography），使arrestin在基础态和GPCR结合样构象中的结构表征，以及GPCR–arrestin复合物在完全结合和部分结合构象中的结构表征成为可能。这些结构见解推进了对arrestin向GPCR结合构象转变及其被不同GPCR选择性结合的分子机制的理解。磷酸化依赖性‘条形码’（‘barcode’）假说进一步解释了受体磷酸化的特定模式如何编码差异性arrestin招募和功能特异性。研究人员讨论了多种生物物理技术，包括核磁共振（NMR）、电子顺磁共振（EPR）和基于荧光的分析方法，这些技术已用于在体外和活细胞中研究arrestin构象动态及GPCR相互作用。

**Introduction**
GPCR（G protein-coupled receptor, GPCR）是最大膜蛋白家族，人类约800成员，具7次跨膜α螺旋及胞外环（ECL）、胞内环（ICL）和N/C端调控。GRAFS分类包括Rhodopsin-Like (Class A)、Secretin-Like (Class B1)、Glutamate (Class C)、Adhesion GPCRs (Class B2)、Frizzled/Taste2 (Class F)。Rhodopsin-like最大且研究最多，配体多样并参与肿瘤、肥胖和代谢病，约34% FDA药物靶向GPCR。配体稳定不同构象，GRK（G protein-coupled receptor kinase, GRK）磷酸化ICL和C端，增强arrestin高亲和结合，介导脱敏、内化与替代信号；GPCR还可从早期内体、核膜、线粒体和高尔基体等区室信号。

**Arrestins**
Arrestin家族含视觉arrestin-1/4（视杆和视锥）及非视觉arrestin-2（β-arrestin-1）和arrestin-3（β-arrestin-2）；后两者广泛表达并调控大量GPCR。

**Structure of arrestin in basal conformation and its transition to the GPCR-bound conformation**
四个脊椎动物arrestin共享N-domain和C-domain β-三明治结构，中央脊含finger loop、middle loop、lariat loop和C-loop，finger loop为关键受体结合元件。基础态由极性核心（五个带电残基网络，arrestin-1中Arg175–Asp296盐桥）和三元相互作用（C尾、β-strand I和α-helix I间疏水接触）维持，破坏二者使平衡向GPCR结合样状态移动。受体激活后GRK磷酸化ICL和C端，促进arrestin招募和转变，但非严格必需；转变包括C-domain相对N-domain旋转、N-domain磷酸传感器识别磷酸基并置换C尾、破坏极性核心和三元相互作用，以及finger loop、middle loop、back loop和C-loop重排。Finger loop基础态无序，结合后插入受体胞内口袋，部分复合物形成α螺旋，破坏G蛋白偶联并促进脱敏；相关突变可使arrestin无需磷酸化进入GPCR结合样构象。

**Structures of GPCR–arrestin complexes in fully engaged conformation**
Arrestin可通过tail-engagement（主要经磷酸化C尾）和core-engagement（同时接触跨膜核心）结合GPCR。X射线晶体学和cryo-EM（cryo-electron microscopy, cryo-EM）已解析多种core-engagement复合物。首个rhodopsin–arrestin-1结构由XFEL（X-ray free-electron laser, XFEL）获得，揭示finger loop与TM7 C端、helix 8 N端和ICL1接触，middle loop/C-loop与ICL2、back loop与TM5 C端接触，finger loop邻近β链接触TM5/TM6/ICL3，arrestin β-strand I与受体C尾形成分子间β折叠。后续NTSR1、M2R、β1AR、5-HT2BR、V2R、CB1、ACKR3和GPR1等复合物显示arrestin相对受体取向有O1和O2两类，但均通过中央脊环保守识别受体，C-edge环与膜作用稳定。多数复合物采用V2R尾融合及Fab30等稳定剂，可能引入构象偏倚；仅少数含天然C尾。此处Class A/B指受体–arrestin相互作用模式（短暂/弱与稳定），不同于GPCR Class A–F。比较显示finger loop持续插入激活受体跨膜束，是完全结合的关键决定因素；middle/lariat/C-loop稳定界面，插入深度、接触残基及磷酸化依赖作用因受体而异。突变研究支持finger loop、middle loop和C-loop突变降低受体结合；PTH1R研究支持arrestin-2同时接触磷酸化C端和跨膜核心，提示class B1与class A机制相似。

**Structures of GPCR bound arrestins in partially engaged (or tail) conformation**
Tail-engaged构象见于β2AR和GCGR与V2R尾融合复合物。β2V2R可同时招募Gs和arrestin-2；GCGR在apo和glucagon结合态均只见arrestin-2与V2R尾作用而非受体核心，GCGR保持基础构象，提示招募由尾磷酸化驱动且不需胞内腔开放。Finger loop不插入跨膜束，与核心作用有限，但C-loop和lariat loop与GCGR helix 8接触。该构象可介导内吞和內体持续信号。尚无天然未修饰受体C尾的tail-engaged arrestin结构；神经肽Y1受体中arrestin-3可稳定结合磷酸化C尾而不需finger loop插入。Tail构象可能为瞬态中间体，并提出双相机制：先经N-domain结合磷酸化C尾，再finger loop插入核心，空间阻碍G蛋白偶联。缺乏受体核心仍可结合arrestin-2提示核心作用对脱敏关键，tail结合可能足以信号。Class B GPCR经tail构象强而持续结合支持内化和信号而不脱敏G蛋白；class A如β2AR结合较弱，tail构象不稳定。缺finger loop的arrestin-2突变可形成tail但不形成core，保留内化和arrestin信号而不脱敏G蛋白；GPCR–Gs–arrestin megacomplexes亦支持tail-engaged arrestin不完全脱敏G蛋白。Fab30/scFv30/Nb32等构象稳定剂用于可视化，Fab7可识别arrestin-2和arrestin-3的GPCR结合构象且不接触受体多肽。

**Arrestin interaction with plasma membrane**
C-edge与膜作用最初由定点荧光提出，后获结构和分子动力学支持。视觉arrestin中受体诱导构象变化暴露疏水残基，C-edge环插入脂双层使arrestin附着质膜。Arrestin-3膜招募不依赖该机制，而依赖C-domain内替代磷酸肌醇结合位点。C-domain磷酸肌醇结合位点与GPCR跨膜核心结合促进且不依赖C尾磷酸化；C-edge膜作用依赖受体尾磷酸化。基础arrestin-3可预结合膜促进后续受体–arrestin-3作用。不同复合物中arrestin倾斜角不同，受去垢剂胶束或脂双层影响，甚至同一受体–arrestin对也不固定。磷酸肌醇和脂双层稳定质膜上GPCR结合构象；IP₆（inositol 1,2,3,4,5,6-hexakisphosphate, IP₆）与arrestin-2多位点作用促进寡聚化并调节胞质水平，PIP₂（phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate, PIP₂）和PIP₃（phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate, PIP₃）增强并稳定非视觉arrestin的GPCR结合构象。Class A GPCR因胞内磷酸化有限需PIP₂作用，class B GPCR广泛磷酸化可不依赖磷酸肌醇招募β-arrestin；clathrin包被结构中PIP₂富集可在无GPCR时积累催化激活arrestin。

**GPCR phosphorylation and barcode hypothesis**
人类GRK1–7调控GPCR信号，GRK1/GRK7在视锥，GRK4组织受限，数百非视觉GPCR主要由GRK2、3、5、6调控。Arrestin识别GPCR磷酸化残基，常在C端，如rhodopsin和Y2神经肽Y受体；磷酸化非严格必需但显著增强亲和并主要决定招募。某些GPCR关键位点在ICL3或ICL2。磷酸化barcode假说认为不同配体和GRK产生特定磷酸化模式，调节arrestin结合、构象和下游功能；同一GPCR被不同GRK磷酸化可触发不同反应。Arrestin-1–rhodopsin结合依赖磷酸化残基总数，而其他研究显示C尾不同磷酸化模式诱导arrestin结构多样结合构象并导致不同细胞反应。β2AR中GRK2磷酸化主要促进内化，GRK6促进arrestin依赖ERK激活，但arrestin在ERK激活中作用仍有争议。β2AR在isoproterenol与偏倚配体carvedilol下磷酸化模式不同；血管紧张素II受体中GRK2/3磷酸化促进内化不诱导ERK，GRK5/6促进ERK而不依赖内化。GLP-1R中激动剂诱导内化和arrestin-2招募需GRK表达，arrestin-3则不然。PKA（protein kinase A, PKA）和PKC（protein kinase C, PKC）也磷酸化GPCR；β2AR中PKA与GRK产生不同磷酸化模式并影响β-arrestin功能；GLP-1R中PKA磷酸化Ser301促进SUMO化、内化并降低表面表达。

**Biophysical strategies to investigate GPCR–arrestin interactions**
GPCR–arrestin相互作用复杂且瞬时，需生物物理技术补充静态结构：NMR提供原子分辨率动态和界面信息，EPR提供距离约束和柔性信息，FRET/BRET等荧光方法可实时监测体外和活细胞中的arrestin构象转变及GPCR偶联。

**NMR to elucidate arrestin conformational dynamics and GPCR binding**
NMR可揭示晶体学和cryo-EM难以获得的瞬态构象和动态结合。15N标记arrestin-1研究显示heparin和IP₆模拟磷酸化光激活rhodopsin，结合N-domain并诱导C尾完全位移。后续研究arr-1与rhodopsin功能态结合，发现受体磷酸化足以驱动C尾位移，arrestin解离由cis-retinal结合Rho再生触发而非trans-retinal移除。2H/13C/15N标记β2AR C尾显示磷酸化诱导胞内受体表面重排，类似arrestin结合复合物。溶液NMR分析arrestin-2与CCR5衍生磷酸肽，pXpp motif三个磷酸残基对结合和转变关键。19F探针位点掺入arrestin-2 N-domain磷酸结合残基，发现不同GPCR磷酸化模式诱导至少三种构象不同的GPCR结合态，并联系不同下游信号，支持barcode假说。

**Electron paramagnetic resonance**
EPR结合SDSL（site-directed spin labeling, SDSL）检测电子自旋态，对局部结构和环境敏感。蛋白缺乏天然未配对电子，常用nitroxide如MTSL和TOAC选择性引入以报告局部迁移率、溶剂可及性和二级结构。EPR不受蛋白或肽大小及光学性质限制，互补其他结构方法；cwEPR单标记检测构象变化，脉冲EPR如DEER（double electron–electron resonance, DEER）可测两个自旋标签间约15–60–80 ?距离，观察大尺度重排。早期arrestin-1 finger loop标记显示结合Rho*-P时环固定；多位点及N-domain/C尾双标记显示受体激活后C尾显著位移和无序，finger loop仅与Rho*-P结合而不与Rho-P。α-helix I参与受体结合。DEER检测arrestin-1多个环区结合受体后的构象变化，包括finger loop延伸和middle loop向外位移；arrestin-2和arrestin-3结合激活磷酸化rhodopsin时呈类似环动态，提示保守机制。

**Fluorescence-based approaches for studying GPCR–arrestin interactions**
荧光技术具高时空分辨率并适用于活细胞。FRET（F?rster resonance energy transfer, FRET）依赖近距（<10 nm）非辐射能量转移，CFP/YFP及优化变体用于监测GPCR构象和arrestin结合；荧光蛋白较大（如GFP约27 kDa）可能影响功能或造成位阻，故采用小荧光团。自标记标签如tetra-cysteine motif的FlAsH可实现位点特异最小扰动；FlAsH-BRET监测arrestin-3实时构象变化，揭示受体特异性及同一受体不同配体诱导的构象特征；NLuc/FlAsH生物传感器显示arrestin-2和arrestin-3被同一GPCR激活后构象不同，且磷酸化依赖并影响偶联功能。BRET（bioluminescence resonance energy transfer, BRET）以luciferase为供体、荧光团为受体，无需外源激发，避免光漂白和自荧光，已用于高通量arrestin招募、动力学、配体偏倚及GPCR megaplex形成。NanoBiT互补通过NanoLuc LgBiT/SmBiT恢复荧光素酶产生可逆实时信号。BiFC通过荧光蛋白片段重构研究相互作用和定位；PRESTO-TANGO和LinkLight用TEV蛋白酶切割和报告激活监测受体激活与arrestin招募；胞内表达抗体（intrabodies）可活细胞可视化受体结合arrestin复合物并追踪内化。

**Conclusion**
Arrestin是GPCR信号的多功能调节者，其结构特征、激活机制及与受体和细胞膜动态作用已被逐步阐明；不同结合状态GPCR–arrestin复合物结构和barcode假说为受体特异信号结果提供模型，NMR、EPR和荧光等技术不可替代。Cryo-EM已解析大量GPCR–G蛋白复合物，但GPCR–arrestin复合物仍有限，因复合物高度动态且多构象。未来需整合cryo-EM、分子动力学模拟、交联质谱和活细胞FRET等。不同磷酸化模式和受体构象可引导arrestin特定信号与运输结果；arrestin构象可塑性可能解释其识别广泛GPCR。深入理解这些机制有助于开发偏倚配体，选择性促进有益信号并减少不良反应。