海马体介观尺度细胞有序性及其组织结构的定量评估

《Hippocampus》：Quantitative Assessment of Mesoscale Cellular Order and Organization in the Mouse Hippocampus

　　

摘要专业翻译 海马体具有典型的宏观结构特征，其细胞核在不同亚区中呈现致密且异质性的堆积模式。尽管组织特异性的细胞组织已被认为与神经功能相关，但由于海马体细胞密度极高，对其介观尺度细胞组织进行定量分析在技术上一直具有挑战性。为克服这一技术障碍，研究人员开发了计算生物物理组织形态计量学软件（Computational Biophysical Histomorphometry Software，CBHS），这是一条自动化的图像分析流程，旨在量化高密度区域内的细胞核形态以及细胞群体的有序性。将该方法应用于海马体各亚区后，研究人员发现，细胞密度更高的区域——尤其是齿状回（dentate gyrus，DG）——在位置上具有最强的有序性，但在取向上有序性最弱。细胞核形态表现出对局部环境的依赖性，且这种依赖与堆积密度相关。这种关联具有细胞类型特异性，神经元（neurons）的细胞核形态随邻近细胞距离的变化而改变，而星形胶质细胞（astrocytes）则未表现出这一特征，尽管星形胶质细胞本身表现出更大的内在形态变异性。研究结果揭示了海马体组织中存在可重复的介观尺度细胞堆积有序性，并与细胞核驱动的邻近细胞间机械耦合机制相一致。本研究为理解介观尺度组织构建提供了一个定量框架，从而为未来研究提出了可检验的假设。

论文解读

一、研究背景与科学问题

不同脑区在整体拓扑性质上存在内在差异，这些性质源于单个细胞的集体组织方式。然而，这种组织方式长期以来缺乏定量描述，也很少与相应脑区的功能特性建立关联。近年来，细胞集体组织在脑区依赖性功能中的意义日益受到重视，包括其在疾病中作为功能障碍来源的潜在作用。海马体是细胞组织研究中被探讨最多的脑区之一，包含三个主要亚区：CA1、CA3和齿状回（DG），它们在功能和细胞组织上各不相同。在宏观层面，疾病诱导的海马体拓扑改变已有充分记录，主要通过组织尸检和功能性磁共振成像（fMRI）证实；在微观层面，分子疾病机制和靶向治疗则主要借助单细胞形态、亚细胞结构和分子环境进行直接研究。然而，细胞水平的变化如何与宏观全组织神经影像学特征相衔接，目前仍知之甚少。固定组织学评估为观察这两个尺度之间的介观尺度变化提供了窗口，从而能够在量化细胞群体的同时反映塑造宏观特征的微观—介观结构属性的总和。连接三个尺度对于将细胞和分子层面的发现转化为可解释的疾病宏观特征至关重要。

在介观尺度上，细胞堆积和密度已被证明是多种疾病模型中海马结构广泛变化的有价值的定性读出指标。然而，这种关联主要通过定性或半定量方法建立，尚未与其他尺度建立联系。在灵长类动物中，大多数神经元在出生前或出生后早期生成，成年大脑维持相对稳定的神经元群体，位置再分布有限。但当大量紧密堆积的神经元移动数微米时，对集体组织空间结构的累积效应可能十分显著。已有研究表明，细胞空间组织可能比先前假设的更具动态性，并非沿固定轨迹发展，而是对外部环境（如经验和疾病）作出反应。在斑马鱼视网膜等具有类似紧密堆积的组织中，已证实存在细胞核驱动的组织构建，包括细胞堆积有序性与密度之间的关系。这些研究还表明，细胞空间组织本身可能具有功能相关性并可动态改变。因此，定量研究海马体细胞堆积有序性和密度变化，是理解细胞核空间组织的第一步，通过连接不同尺度，可以深入了解介观尺度本身的功能相关性，从而在分子水平与组织水平变化之间架起桥梁。尽管近期已有介观尺度连接性研究方法的报道，但统一的介观尺度海马结构细胞堆积有序性定量框架仍然缺乏。

二、研究内容与主要发现

为填补这一技术与知识空白，并研究高密度海马组织中细胞堆积有序性与密度之间的关系，研究人员开发了计算生物物理组织形态计量学软件（CBHS）。CBHS是一条用于共聚焦图像分析的一体化流程，整合了背景校正、基于CellPose的细胞核分割、三维重建、荧光强度校正和自动化标记阳性细胞过滤，并提供了统一的框架来量化海马体各亚区细胞核的形态、密度和细胞堆积有序性。利用CBHS，研究人员对海马体的介观尺度组织进行了定量表征，发现与斑马鱼视网膜类似，小鼠海马体中的细胞在超过理论密度阈值后表现出细胞组织的有序性。此外，细胞核形态在局部环境结构的影响下发生变化。这些发现揭示了研究脑亚区特异性细胞和组织构建轨迹的原理，可能对组织特异性功能和可塑性至关重要。

三、关键技术方法

研究人员使用3只4月龄雄性C57BL/6J小鼠，经心脏灌注固定后制备40μm冠状切片，进行免疫荧光染色和共聚焦成像。主要技术方法包括：基于形态学开运算和高斯滤波的逐层背景校正方法，用于消除不均匀照明和自发荧光；基于CellPose CPSAM模型微调（使用4249个手工标注细胞核）的二维细胞核分割，并结合掩膜引导的边缘增强和Stardist 3D三维重建；自主研发的Yukimatsu后处理算法，用于恢复轴向截断的核帽并解决欠分割的接触细胞核；基于z-score直方图的自适应标记阳性细胞自动过滤算法；以及基于滑动窗口框架的多种拓扑和几何指标计算，包括径向分布函数（RDF）、二点熵（S?）、局部向列序参数（S?）、配位数（Z）、核密度和细胞核间距（INCD）等。

四、研究结果

3.1 高密度脑区细胞核的强度处理与分割。 研究人员首先验证了CBHS背景校正方法的效果。与三次样条背景减除和未校正图像相比，CBHS方法产生了更平坦的整体背景强度（Kruskal–Wallis检验显著，CBHS中位数最低），并降低了残差的低频光谱能量，表明其能更有效地校正不同细胞密度区域间的背景强度变化。随后，研究人员将CellPose CPSAM模型用4249个手工绘制的细胞核进行微调，在5张包含1446个标注细胞核的验证图像上，微调后的模型在精确率（0.78提升至0.86）、召回率（0.86提升至0.89）和F分数（0.81提升至0.87）上均优于未调优基线。在三维重建方面，研究人员比较了二维圆度与三维球形度，发现标准化为z-score后两者分布统计上不可区分，因此后续分析均在二维切片上进行。标记阳性细胞过滤方面，研究人员开发了直方图算法，与手工计数相比，自动化Sox2阳性百分比无显著差异（配对Wilcoxon检验不显著，平均差异极小）。

3.2 海马体各亚区的位置有序性与取向有序性。 研究人员使用滑动窗口框架，比较了DG、CA1、CA3和皮层四个区域的位置有序性和取向有序性。在基本组织学特征方面，DG表现出最小的细胞核间距（INCD）和最高的核密度（覆盖率约0.43），其次是CA1、CA3和皮层。径向分布函数（RDF）分析显示，DG具有最高且最早的第一个峰，表明其位置有序性最强，CA1和CA3次之，而皮层的RDF基本平坦，表明近随机分布。二点熵（S?）分析进一步证实DG具有最低的S?值（即最强位置有序性），且DG与每个亚区均存在显著差异。配位数（Z）分析显示，DG每个细胞核平均拥有最多的Delaunay邻居（Z=6.21），其次是CA1（Z=5.98）、CA3（Z=5.84）和皮层（Z=5.71）。取向有序性方面呈现相反趋势，DG的细胞核排列最不整齐（S?=0.31），CA1次之，而CA3和皮层排列最整齐且统计上不可区分。

3.3 海马体各亚区有序性与密度的关系。 研究人员对全部滑动窗口进行了线性和非线性拟合。线性拟合显示，仅DG表现出位置有序性与密度之间的明确单调关系——密度越高，S?越低，即位置有序性增强；而CA1、CA3和皮层的关系基本平坦。相比之下，所有亚区的取向有序性均与密度呈负相关。LOWESS拟合揭示了DG和CA1中S?—密度关系存在分段断点，断点位于核覆盖率约0.4处，超过该断点后位置有序性急剧上升。分段回归确认了每个亚区均存在显著断点，DG断点位于覆盖率0.42，CA1位于0.40。对CA1密度最高四分位窗口的OLS拟合证实了该范围内密度与位置有序性之间存在陡峭且稳健的负相关。取向有序性则随密度增加而持续下降，并在高密度区域（覆盖率约0.4）趋于平台期。

五、结论与意义

本研究通过开发CBHS这一自动化图像分析流程，首次实现了对高密度海马组织介观尺度细胞堆积有序性的定量表征。研究发现，海马体各亚区在细胞堆积有序性上存在可重复的差异：密度最高的DG表现出最强的位置有序性但最弱的取向有序性，细胞核形态受局部堆积环境影响且具有细胞类型特异性——神经元而非星形胶质细胞的核形态随邻近细胞距离变化。这些结果与细胞核驱动的邻近细胞间机械耦合机制一致，表明海马组织中存在可重复的介观尺度细胞堆积有序性。本研究提供了一个理解介观尺度组织构建的定量框架，为未来研究海马体亚区特异性功能与可塑性、以及疾病状态下细胞组织动态变化提供了可检验的假设基础。