赤拟谷盗Furin 1同源基因TcFur1调控生殖与碳水化合物代谢而不影响脂质稳态

《Insect Molecular Biology》：TcFur1, a furin 1 ortholog in Tribolium castaneum, regulates reproduction and carbohydrate metabolism without affecting lipid homeostasis

　　

摘要专业翻译 枯草杆菌蛋白酶家族的蛋白转化酶（proprotein convertases）通过加工蛋白前体，调控发育、代谢和生殖等关键生物学过程。Furin 1（Fur1）在昆虫中的作用仍知之甚少，尤其是在储粮主要害虫赤拟谷盗（Tribolium castaneum）中。本研究描述了TcFur1同源基因，并探究其对发育、生殖和能量代谢的影响。系统发育分析证实TcFur1与其他昆虫的1型furin存在1:1直系同源关系。定量PCR（qPCR）表达谱分析表明，TcFur1在蛹期表达量最高，提示其在变态发育中发挥作用。RNA干扰（RNAi）介导的基因敲低不影响存活率和发育，但显著降低雌成虫的产卵量。三酰甘油（triacylglycerol，TAG）水平和总脂肪酶活性均保持不变，表明在上述条件下TcFur1对脂质稳态并非必需。相反，TcFur1敲低增加了循环海藻糖水平，并降低了胰岛素样肽（TcILP1和TcILP2）及脂动激素受体（TcAKHR）的转录水平（经qPCR测定）。由于缺乏特异性抗体，相应的蛋白水平未予测定，但这些转录变化与TcFur1在碳水化合物代谢内分泌调控中的作用一致。上述结果表明，TcFur1参与赤拟谷盗的碳水化合物稳态和生殖调控，可能通过胰岛素和AKH信号通路发挥作用，而不直接影响脂质代谢。该数据拓展了目前对昆虫蛋白转化酶功能的认识，并提示TcFur1可作为基于RNAi的种群防控的潜在靶点。

论文解读

一、研究背景与科学问题

蛋白转化酶（proprotein convertases，PCs）属于枯草杆菌蛋白酶家族，通过识别并切割前体蛋白中碱性氨基酸残基位点，激活多种分泌蛋白和膜蛋白，从而参与发育、代谢和生殖等广泛的生物学过程。在脊椎动物中，furin（PCSK3）是该家族的原型酶，近年研究揭示循环furin水平与体重指数和空腹血糖等代谢指标密切相关，FURIN基因的功能减弱突变可损害胰岛素受体前体的加工，可能与2型糖尿病相关。在模式昆虫黑腹果蝇中，存在dfur1和dfur2两个furin同源基因，参与BMP配体成熟、体液免疫应答及重要发育信号通路的调控。然而，furin在其他昆虫类群中的功能仍缺乏系统研究，尤其在鞘翅目昆虫中几乎空白。

赤拟谷盗（Tribolium castaneum）是全球重要的储粮害虫，同时具有基因组已测序、RNAi响应高效、易于饲养等优点，是研究昆虫基因功能的理想模式生物。尽管该物种的蛋白转化酶体系已有部分表征，但1型furin直系同源基因（Fur1）的具体功能——特别是在变态发育、生殖和能量代谢中的作用——尚不清楚。基于此，研究人员开展了本研究，旨在系统鉴定赤拟谷盗TcFur1基因，并阐明其在发育、生殖和代谢中的功能。

二、研究内容与主要结论

研究人员通过系统发育分析确认TcFur1（TC010869）与其他昆虫的1型furin形成1:1直系同源关系。发育表达谱显示，TcFur1在幼虫期表达较低，蛹期显著升高，在成虫羽化后第1天达到峰值，随后迅速回落至基础水平，提示该基因参与变态过程和早期成虫成熟。RNAi介导的基因敲低实验表明，TcFur1敲低不影响幼虫存活率和发育进程，但导致雌成虫产卵量显著下降约62%。代谢分析显示，TcFur1敲低不影响三酰甘油（TAG）积累和总脂肪酶活性，脂质稳态未受干扰；但循环海藻糖水平显著升高约2.75倍，而总糖和糖原水平不变。分子机制研究揭示，TcFur1敲低使TcILP1和TcILP2表达分别下降约70%和80%，TcAKHR表达下降约60%，而TcTPS、TcGAPDH和TcPEPCK等糖代谢关键酶基因表达不变。上述结果表明，TcFur1通过胰岛素和AKH信号通路参与碳水化合物稳态调控，并影响生殖能力，但不直接参与脂质代谢调控。

三、主要技术方法

研究人员主要运用以下关键技术方法开展研究：基于Pfam结构域序列的系统发育分析（最大似然法构建进化树）；qPCR技术检测不同发育阶段（3、4、5mm幼虫、蛹及羽化后1、4、7、15天成虫）的基因表达谱；体外转录合成dsRNA并通过显微注射实施RNAi基因敲低；采用蒽酮法分别定量总糖、海藻糖和糖原，Lowry法定量总蛋白，酶法试剂盒测定TAG含量，以DMPTB为底物测定总脂肪酶活性；qPCR检测糖代谢相关基因（TcTPS、TcGAPDH、TcAKHR、TcPEPCK、TcILP1、TcILP2）的表达变化。实验所用赤拟谷盗品系为实验室饲养种群，饲养于30°C恒温培养箱中，以小麦粉为基质。

四、研究结果

TcFur1的系统发育鉴定与表达谱。 系统发育分析表明，TcFur1位于1型furin进化支，与果蝇dfur1和白蜡窄吉丁等物种的furin 1形成1:1直系同源关系。发育表达分析显示，TcFur1在蛹期表达显著升高，在羽化后第1天成虫中达到最高水平，随后迅速下降，表明其参与变态发育和早期成虫成熟过程。高脂饮食（HFD）不影响TcFur1的表达水平。

TcFur1敲低的表型效应。 注射dsTcFur1后，幼虫体内TcFur1转录水平显著降低，证实敲低有效。敲低组存活率约96%，与对照组（100%）无显著差异；发育进程分布（幼虫、蛹、成虫比例）在两组间亦无显著差异，表明TcFur1敲低不影响存活率和发育速率。然而，TcFur1敲低组雌成虫产卵量（约0.28mg/成虫）较对照组（约0.73mg/成虫）显著减少，表明TcFur1在生殖中发挥重要作用。

脂质代谢不受TcFur1敲低影响。 TcFur1敲低后，5mm幼虫的TAG水平（两组均为0.15μg/μg蛋白）和总脂肪酶活性（对照组约6U，敲低组约5U）均与对照组无显著差异，表明TcFur1在上述条件下不参与脂质稳态调控。

TcFur1调控碳水化合物稳态。 TcFur1敲低后，总糖水平（对照组约0.08μg/μg蛋白，处理组约0.07μg/μg蛋白）和糖原水平（对照组0.089μg/μg蛋白，处理组0.085μg/μg蛋白）均无显著变化，但海藻糖水平显著升高（处理组约0.011μg/μg蛋白，对照组约0.004μg/μg蛋白）。两组间总蛋白含量无差异，排除了归一化偏差。基因表达分析显示，TcILP1表达下降约70%，TcILP2下降约80%，TcAKHR下降约60%，而TcTPS、TcGAPDH和TcPEPCK表达不变，表明TcFur1选择性影响胰岛素和AKH信号通路的内分泌调控组分。

五、讨论与结论

讨论部分指出，TcFur1敲低未引起脂质表型可能归因于与其他转化酶的功能冗余、apoLp-II/I切割并非脂运蛋白组装分泌的必要条件，或转录敲低后furin仍保留残余活性。产卵量下降的机制可能涉及TcFur1直接加工卵黄原蛋白（Vg）前体，也可能是代谢失衡间接损害卵子发生，两者可能并存。海藻糖升高看似与AKHR表达下降矛盾，但研究人员提出，胰岛素信号减弱导致组织对海藻糖摄取利用减少，即使AKH动员功能受损，仍可造成海藻糖在血淋巴中积累。此外，海藻糖升高可能源于糖异生途径从氨基酸前体合成，而非糖原动员。研究局限性包括：未测定蛋白水平（缺乏特异性抗体）、全身性敲低无法区分组织特异性效应、未评估卵存活率和后代发育。未来研究方向包括降解组学鉴定直接底物、pAkt磷酸化检测、组织特异性RNAi、TcFur1/TcFur2双敲低及候选底物体外切割验证。

研究结论：TcFur1是赤拟谷盗中1型furin的1:1直系同源基因，参与碳水化合物稳态和生殖调控，可能通过胰岛素和AKH信号通路发挥作用，而不直接影响脂质代谢。TcFur1敲低在不引起死亡的前提下显著降低产卵量，提示该基因可作为基于RNAi的害虫种群防控的潜在靶点，为环境友好的储粮害虫治理提供新思路。同时，昆虫胰岛素/AKH通路与脊椎动物胰岛素/胰高血糖素系统的类比性，使赤拟谷盗有望成为人类代谢疾病研究的转化模型。