配体结合蛋白 RmcM 与替代σ54因子 RpoN 对 Stutzerimonas stutzeri MJL19 中 c-di-GMP 信号及 GABA/5-氨基戊酸响应的贡献

《Microbiological Research》：Contribution of the ligand binding protein RmcM and the alternative sigma factor RpoN to c-di-GMP signaling in Stutzerimonas stutzeri MJL19

　　

• rmcM 缺失导致在群体水平检测到的 c-di-GMP（cyclic dimeric guanosine monophosphate，环二鸟苷酸）含量出现变异。
• GABA（γ-aminobutyric acid，γ-氨基丁酸）和 5-氨基戊酸（5-aminovaleric acid）是调节 S. stutzeri MJL19 中 c-di-GMP 水平的环境线索，部分通过 RmcM 实现。
• RpoN（替代σ因子σ⁵⁴）调控运动性、细胞-细胞相互作用和 c-di-GMP 水平。

研究背景：c-di-GMP（cyclic dimeric guanosine monophosphate，环二鸟苷酸）是细菌重要第二信使，参与细胞分裂、分化、生物膜形成与分散、运动性、群体感应、致病性和次级代谢等过程。其合成由含 GGDEF 结构域的 DGC（diguanylate cyclase，二鸟苷酸环化酶）催化，水解由含 EAL 或 HD-GYP 基序的 PDE（phosphodiesterase，磷酸二酯酶）完成。高 c-di-GMP 通常促进黏附蛋白、胞外多糖和胞外聚合物产生及生物膜生活方式，而 c-di-GMP 降解常关联运动性单细胞生活方式。特定 DGC/PDE 可表现局部效应或过程特异性，许多 DGC/PDE 含感觉或调控结构域，但多数信号未知；LBD（ligand binding domain，配体结合结构域）序列分化大，难以按同源性鉴定信号。氨基酸尤其精氨酸是 c-di-GMP 周转的重要调节物；RmcA 含 GGDEF/EAL 和 N 端周质 LBD，结合精氨酸并在特定条件下作为 PDE。S. stutzeri MJL19 是大豆根高效定殖菌，盐胁迫下促植物生长，在非生物和生物表面成膜，c-di-GMP 水平高并受 NaCl 调节；其唯一含 SBP_bac_3（bacterial extracellular solute-binding proteins family 3，细菌胞外溶质结合蛋白家族3）型 LBD 的 GGDEF 蛋白及其与 RpoN（替代σ⁵⁴因子）的关系不清，故开展研究。

研究人员构建 rmcM 缺失及 ΔrmcM-rpoN* 等菌株，发现 GABA 和 5-氨基戊酸经 RmcM 的 SBP_bac_3 结构域调节第二信使信号，并揭示 RpoN 在 c-di-GMP 周转和盐响应中的作用；结果支持 RmcM 为配体依赖 DGC、RpoN 调控运动性、细胞互作和盐响应，为 MJL19 生活方式转变和根际适应提供线索。

技术方法：研究以 S. stutzeri MJL19（Nf^r）为出发菌株，构建 ΔrmcM、ΔrmcM-rpoN* 及互补/荧光标记菌株，并以 P. putida KT2440 为异源宿主；用全基因组测序确认突变，纯化 RmcM-LBD 进行热位移筛选和 ITC（isothermal titration calorimetry，等温滴定量热法）鉴定配体；以 pCdrA-oriT 生物传感器行荧光定性和定量，并用 ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay，酶联免疫吸附测定）检测 c-di-GMP；结合运动性、生物膜、刚果红结合、聚集、TEM（transmission electron microscopy，透射电子显微镜）表型分析及蛋白结构建模/分子对接。未涉及样本队列。

研究结果：3.1 含 LBD 的推定 DGC 鉴定与敲除：通过 MiST 4.0 搜索 MJL19 基因组，鉴定 41 个潜在 c-di-GMP 代谢蛋白（21 个 GGDEF、2 个 EAL、2 个 HD-GYP、16 个双结构域）及 8 个 PilZ 域蛋白；WRQ02434.1 具周质 N 端 SBP_bac_3 型 LBD、跨膜区和胞质 GGEEF 基序 DGC 域。敲除 U3Q39_018055 并命名 rmcM，得两株 ΔrmcM，其中平滑型携带 rpoN G→C 点突变致 RpoN 第498位 Arg→Pro；该区域最后9个残基高度保守并决定σ⁵⁴对靶启动子 DNA 亲和性，命名 rpoN*。结论：MJL19 存在结构简化的推定 DGC RmcM，并获 ΔrmcM 和 ΔrmcM-rpoN* 用于比较。

3.2 ΔrmcM 与 ΔrmcM-rpoN* 表型表征：通过 mCherry 标记、玻璃管/牙签生物膜、荧光显微、聚集观察、0.3% 琼脂运动性和 TEM，发现两突变体可见生物量略降但木面细胞荧光增加，提示基质数量/组成改变而附着细胞增多；ΔrmcM-rpoN* 聚集几乎消失，ΔrmcM 聚集体较小；ΔrmcM-rpoN* 泳动显著降低且鞭毛稀少，ΔrmcM 泳动略增并有弥散胞外物。结论：RmcM 和 RpoN 影响生物膜基质、聚集和运动性。

3.3 RmcM 和 RpoN 在 c-di-GMP 水平调控中的作用：通过 pCdrA-oriT 动力学、ELISA 和荧光显微，发现 ΔrmcM 相对荧光持续时间更长且峰值更高，群体内变异大；rpoN* 几乎消除升高并使水平低于野生型；ELISA 显示稳定期 ΔrmcM c-di-GMP 近4倍于野生型；显微显示 ΔrmcM-rpoN* 信号近不可测，ΔrmcM 异质性更大。结论：rmcM 缺失在群体水平引入 c-di-GMP 含量变异，RpoN 影响 c-di-GMP 水平。

3.4 多拷贝 RmcM 表现为 DGC：通过 pBB5-rmcM 多拷贝、生长/泳动/刚果红和异源 P. putida KT2440，发现多拷贝 RmcM 降低浮游生长、降低泳动、增加刚果红结合并提高 c-di-GMP；在 KT2440 中亦显著提高荧光。结论：RmcM 在多拷贝时表现 DGC 活性，但其调控受遗传背景影响。

3.5 RmcM 配体鉴定：通过纯化 RmcM-LBD、Biolog PM3B 热位移和 ITC，发现 L-Arg、胍丁胺、GABA 和 5-AV 引起 Tm 升高，ITC 确认 GABA（K_D=2.46±0.1 μM）和 5-AV（K_D=0.94±0.08 μM）结合，Arg/胍丁胺结合可忽略，Lys 为阴性；对接预测 GABA 由 W67/W28 夹持并有 R91/N86/F135 氢键，5-AV 与 R91/F135/D25 氢键。结论：RmcM-LBD 选择性结合 GABA 和 5-AV。

3.6 GABA 与 5-氨基戊酸对 c-di-GMP 产生的影响：通过外源 5 mM GABA 或 5-AV 处理野生型、ΔrmcM、互补菌株及异源 KT2440，发现野生型荧光分别约增4倍和6倍；ΔrmcM 响应减弱，说明还有 RmcM 非依赖机制；互补 ΔrmcM 未恢复响应，GABA 效应消失、5-AV 响应低于未互补突变体；KT2440 中仅含 RmcM 者响应两配体且 5-AV 更强；振荡条件下 RmcM 多拷贝响应两化合物并增生物膜，静置条件响应消失。结论：GABA/5-AV 可调节 c-di-GMP，部分经 RmcM，并受遗传背景和通气条件影响。

讨论与结论：讨论指出，RmcM 是 MJL19 唯一含 SBP_bac_3 型 LBD 的推定 DGC，结构较 RmcA 简单；rmcM 缺失反而升高整体 c-di-GMP，多拷贝升高，提示功能冗余/补偿、局部 c-di-GMP 池和群体异质性；异源宿主中效应更明显提示 MJL19 另有元件影响 RmcM 活性/表达；rpoN* 出现提示σ⁵⁴网络选择压力，可能为补偿、抑制或转录重连；双突变体表型支持 RpoN 调控 c-di-GMP 代谢、运动性和细胞互作。GABA 和 5-AV 结合为熵驱动，亲和力与已知 GABA 受体范围相符；5-AV 亲和力更高且效应更强；GABA 可源于根分泌物或微生物 GABA 支路，5-AV 为赖氨酸分解中间体但 RmcM-LBD 不结合赖氨酸；两配体也存在 RmcM 非依赖效应，多拷贝使响应改变，提示 RmcM 可能与其他蛋白协同并受通气影响。研究结论翻译：综上，上述结果支持一个模型：RmcM 作为配体依赖的 DGC，在富氧条件下响应 GABA 和 5-氨基戊酸刺激 c-di-GMP 产生，可能位于 GGDEF 纳米结构域的超级模块中。另一方面，RpoN 通过调节第二信使产生来调控运动性、细胞-细胞相互作用和对盐度的响应。未来聚焦于鉴定 RpoN 调控 c-di-GMP 产生所作用的靶基因以及 RmcM 信号通路中的其他元件的研究，将有助于拓展对 S. stutzeri MJL19 生活方式转变的认识。