介孔二氧化硅纳米粒介导多柔比星与Withaferin A共递送在非小细胞肺癌中抑制肿瘤生长和血管生成

《Microchemical Journal》：Mesoporous silica nanoparticle-mediated delivery of doxorubicin and withaferin A suppresses tumour growth and angiogenesis in non-small cell lung cancer

介孔二氧化硅纳米粒（mesoporous silica nanoparticles, MSNs）可在肺癌中实现联合药物递送。纳米粒载药经光谱学与表面表征确认。负载多柔比星（doxorubicin, Dox）的纳米粒增强抗癌活性。联合纳米粒降低球状体生长与肿瘤发展。联合纳米粒抑制血管生成相关蛋白信号。

肺癌仍是全球癌症相关死亡的主要原因，2022年估计有250万新发病例和180万死亡病例；非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）约占全部肺癌的85%，包括腺癌、鳞状细胞癌和大细胞癌等亚型。尽管分子靶向治疗和免疫检查点抑制剂取得进展，许多患者仍为晚期，治疗耐药、肿瘤异质性、转移进展和全身毒性持续限制长期疗效，因此需要提高抗肿瘤疗效并减少传统化疗脱靶毒性的策略。多柔比星（doxorubicin, Dox）为蒽环类化疗药，通过DNA嵌入、抑制拓扑异构酶II和产生活性氧发挥抗癌作用，但非特异性生物分布、剂量依赖性心脏毒性和耐药限制其临床应用。Withaferin A（WFA）为源自Withania somnifera的甾体乳糖/醉茄内酯类天然化合物，可调节NF-κB、STAT3、PI3K/Akt、氧化应激、凋亡、上皮–间质转化（epithelial–mesenchymal transition, EMT）和细胞骨架等通路，在肺癌模型中显示抗增殖、抗迁移及抗血管生成作用，但其水溶性和生物利用度差。MSNs具有高比表面积、可调孔道、可修饰表面、生物相容性和载药能力，适合难溶性或细胞毒性药物及联合递送。基于此，研究人员提出MSN包载可递送Dox和WFA、WFA通过互补作用增强抗肿瘤和抗血管生成效应的假设，并开展MSN介导Dox与WFA联合递送用于NSCLC的研究。研究显示载药纳米粒可被H358细胞摄取，Dox-NPs较游离Dox更明显降低细胞活力，Combo-NPs在部分浓度增强活力抑制；载药纳米粒抑制迁移、球状体生长和CAM模型肿瘤生长，Combo-NPs对血管生成相关蛋白信号抑制最持续。结论支持MSN介导Dox/WFA共递送作为NSCLC多靶点治疗策略，意义在于为后续评估递送、安全性、药代和体内疗效提供临床前依据。

关键技术方法：研究人员以St?ber/溶胶–凝胶法合成MSNs，并以TEM、N₂吸附/脱附（BET/BJH）、DLS、UV–vis及zeta电位表征；进行Dox、WFA单载与顺序双载。细胞为NCI-H358（ATCC, Manassas, VA），由Dr. Lakis Liloglou, Edge Hill University and University of Liverpool, Liverpool, UK赠予；CAM实验使用受精Dekalb White鸡蛋（Medeggs, UK）。功能评估采用resazurin活力、划痕、3D球状体、CAM瘤模型及免疫荧光；机制采用Human Apoptosis Array与Human Angiogenesis Array抗体微阵列。

研究结果：
3.1 Synthesis and characterization of mesoporous silica nanoparticles：TEM显示球形MSNs平均377±40 nm；N₂等温线及滞后环证实介孔，孔容2 cm³/g、BET表面积约961 m²/g；DLS粒径高于TEM提示水相聚集；UV–vis与zeta电位变化（未载7.6±1.5 mV，Dox-NPs ?8.6±0.9 mV，WFA-NPs ?29.5±5.4 mV）确认单载和共载，支持其作为载药平台。
3.2 Cellular and intracellular localisation of doxorubicin, doxorubicin-loaded nanoparticles and withaferin A：荧光显微镜48 h显示游离Dox呈较广胞内及核相关荧光，Dox-NPs呈点状胞内分布并持续滞留，WFA-NPs可见胞质内荧光及细胞铺展和actin组织改变，支持纳米粒进入细胞。
3.3 Doxorubicin-loaded nanoparticles reduce H358 cell viability：resazurin 48 h显示游离Dox降低H358活力/代谢活性，Dox-NPs在5和2.5 μM较游离Dox更明显降低，提示纳米递送增强Dox抑制活力，尤其高浓度。
3.4 Withaferin A reduces H358 cell viability：游离WFA与WFA-NPs均浓度依赖降低活力，5 μM最明显；两者无显著差异，说明该实验条件下WFA纳米包裹未显著增强活力抑制。
3.5 Combination doxorubicin/WFA-loaded nanoparticles reduce H358 cell viability：游离Dox/WFA与Combo-NPs均浓度依赖降低活力；Combo-NPs在最高浓度和1.25 μM较游离联合显著更强，2.5和0.625 μM无显著差异，提示共递送在选定浓度增强联合抑制。
3.6 Doxorubicin-, WFA- and combination-loaded nanoparticles inhibit H358 cell migration at low dose：0.625 μM划痕48 h中未处理与纳米粒对照迁移相近，游离Dox/WFA、Dox-NPs、WFA-NPs、Combo-NPs均降低迁移；Dox-NPs最强，Combo-NPs与其相近，低剂量下加WFA未见进一步增强Dox-NPs抗迁移。
3.7 Doxorubicin, WFA and combination-loaded nanoparticles reduce NSCLC spheroid growth in a 3D tumour model：7天球状体显示游离和纳米Dox均缩小球状体；WFA/WFA-NPs效应较温和且包裹未明显增强；Dox/WFA联合缩小最明显且呈浓度依赖，Combo-NPs较游离联合更明显，支持3D模型中共递送增强抗肿瘤。
3.8 Doxorubicin, WFA and combination-loaded nanoparticles suppress tumour growth in the CAM model：CAM血管化模型中所有药物治疗组均显著缩小肿瘤面积；游离Dox和游离联合明显，WFA较温和；纳米制剂中Dox-NPs降幅最大，其次Combo-NPs和WFA-NPs，支持MSNs在血管化微环境中抗肿瘤。
3.9 Nanoparticle treatments modulate apoptosis- and angiogenesis-associated protein expression：抗体阵列显示DOX-NPs升高Bad、Bax、cleaved caspase-3、Fas/TNFRSF6/CD95、HSP27、p21/CIP1/CDKN1A、survivin等；WFA-NPs亦改变死亡受体、应激和细胞周期相关标志；Combo-NPs呈较广但总体中等凋亡谱。血管生成阵列中对照NPs高IL-8、uPA、VEGF；DOX-NPs降低amphiregulin、IL-8、thrombospondin-1、uPA、VEGF；WFA-NPs反应混合；Combo-NPs对所评估血管生成相关蛋白持续低信号，提示抑制血管生成信号。

讨论总结：讨论指出MSN递送可改变胞内转运、滞留和释放；Dox-NPs增强作用与改善递送和控释的思路一致；WFA-NPs在2D活力无显著增强可能与释放、胞内可用性、检测时间或resazurin代谢读数敏感性有关；联合可能通过DNA损伤、拓扑异构酶II抑制、氧化应激与WFA对生存、炎症、细胞骨架和血管生成通路的作用产生互补。划痕、3D和CAM结果支持共递送影响活力、迁移、球状体及血管化肿瘤生长；阵列提示凋亡、死亡受体、应激、细胞周期和抗血管生成信号参与，尤其Combo-NPs。未来需多NSCLC模型、载药与释放动力学、胞内运输、阵列靶点验证、复杂3D/共培养、CAM血管参数及体内分布、安全性、药代和疗效研究。研究结论翻译：总之，本研究表明，介孔二氧化硅纳米粒介导的多柔比星、WFA及多柔比星/WFA联合治疗可抑制NSCLC模型中的关键肿瘤相关行为。载药纳米粒降低细胞活力/代谢活性、损害迁移、减少球状体生长，并抑制CAM模型中的肿瘤发展。联合载药纳米粒在活力、迁移和3D球状体试验中表现出特别强的作用，支持MSN介导共递送的潜在价值。机制分析进一步提示涉及凋亡相关通路及对血管生成相关信号传导的抑制，尤其在联合纳米粒治疗后。这些结果支持MSN介导的多柔比星与WFA共递送作为NSCLC多靶点治疗策略的潜力。