《Molecular & Cellular Proteomics》：In situ polymerized monolith tips for reproducible, format-flexible proteomic sample preparation applied to biofluids
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样品制备日益成为制约基于质谱（mass spectrometry, MS）的蛋白质组学通量和可重复性的瓶颈。StageTips及其变体长期以来是纯化样品的常用工具，研究人员最近将该概念扩展至固相萃取捕获（solid-phase extraction captu
样品制备日益成为制约基于质谱（mass spectrometry, MS）的蛋白质组学通量和可重复性的瓶颈。StageTips及其变体长期以来是纯化样品的常用工具，研究人员最近将该概念扩展至固相萃取捕获（solid-phase extraction capture, SPEC）吸头，其中整个酶解过程在亚微升级体积内进行。研究人员用由特定配方光聚合而成的整体柱（monolith）替代手工填充的固定相床层，该整体柱直接在移液器吸头内部聚合（即polymerized SPEC, pSPEC），本研究采用强阴离子交换（strong anion-exchange, SAX）化学实现。液体处理机器人在数分钟内即可铸造384个可调谐吸头，成本低廉且适用于任意规格，对工作流程方差的贡献极小。在多种生物体液中，与血浆的溶液内酶解相比，pSPEC增加了约20%的鉴定量，并在每天100个样品的通量下，从单次进样的健康人尿液和唾液中分别鉴定到3,500个和4,800个蛋白质组（protein groups），这一深度通常需要通过去除高丰度蛋白或预分级才能达到。这种光铸方法有望进一步拓展至单细胞、亲和捕获和大规模人群研究。
研究背景与现存问题
基于质谱（mass spectrometry, MS）的蛋白质组学已发展为能够从单细胞到临床队列规模进行深度定量蛋白质分析的技术。然而，在大规模应用中，样品注入液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS）分析前的净化步骤仍是限制通量和可重复性的关键瓶颈。StageTips（stop-and-go extraction tips）及其衍生技术如管内样品制备（in-StageTip, iST）、过滤辅助样品制备（filter-aided sample preparation, FASP）等虽已实现了在单个吸头内完成还原、烷基化和酶解等操作，但其性能决定组件——固定相——仍需手工装填。手工装填不仅速度慢、难以规模化（仅能制作数百个吸头），且因操作者差异导致床层密度、结合能力和背压波动，最终影响定量结果的重复性。因此，亟需一种能够消除手工操作变异、实现大规模标准化生产的样品制备平台。
研究内容与结论
为解决上述问题，研究人员开发了聚合物固相萃取捕获（polymerized solid-phase extraction capture, pSPEC）平台，其核心创新在于将强阴离子交换（strong anion-exchange, SAX）整体柱（monolith）通过紫外光（ultraviolet, UV）引发聚合的方式，直接在标准聚丙烯移液器吸头内原位成型。该平台利用液体处理机器人，可在数分钟内批量铸造384个吸头，且吸头的几何结构、孔隙率、结合容量等性能参数完全由聚合配方定义，而非手工操作，从而从根本上保证了制备的均一性和可重复性。研究结果表明，pSPEC在血浆样品中比传统溶液内酶解多鉴定约20%的蛋白质组（protein groups），且在每天100个样品的通量下，从单次进样的健康人尿液和唾液中分别鉴定到3,500和4,800个蛋白质组，这一深度通常需要通过免疫去除高丰度蛋白或预分级才能达到。该平台还展现出优异的机械稳定性和批次间重现性，其方差几乎不随制备环节的增加而累积。该方法有望进一步推广至单细胞蛋白质组学、亲和捕获及大规模人群队列研究。
主要关键技术方法
- 1.
原位光聚合吸头制造：使用Agilent Bravo液体处理平台，将含有功能单体[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基]三甲基氯化铵（[2-(methacryloyloxy)ethyl]trimethylammonium chloride, METAC）、交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯（ethylene glycol dimethacrylate, EDMA）和三元致孔剂（1-丙醇/己醇/水）的前驱液吸入384个标准30 μL聚丙烯吸头，随后经三步阶梯功率的365 nm UV照射固化成型。
- 2.
固相萃取捕获（SPEC）样品制备工作流：采用双吸头构型，蛋白质首先被SAX整体柱捕获，在纳升级受限孔空间内完成酶解，随后以肽段形式洗脱至C18 Evotip上进行LC-MS分析。
- 3.
材料表征：通过氮气吸附法（BET）、汞侵入孔隙度测定法、氦比重瓶法测定整体柱的比表面积、孔径分布和总孔隙率；采用阴离子偶氮染料甲基红滴定法测定可逆阴离子交换容量；通过K562裂解液的梯度突破滴定实验评估动态蛋白负载容量。
- 4.
质谱数据采集与分析：使用Evosep Eno液相色谱系统耦合Orbitrap Astral或timsUltra 2质谱仪，采用数据非依赖采集（data-independent acquisition, DIA）模式；原始数据经DIA-NN软件（v2.2.0）基于人类UniProt Swiss-Prot异构体数据库（42,439条条目）进行深度学习和谱图匹配分析，错误发现率控制在1%。
- 5.
实验设计与统计：研究涉及18名健康成年捐赠者的血浆、尿液和唾液三种生物体液队列，每种样品制备技术重复三次；通过嵌套设计评估前驱液配制、吸头制造和样品制备三个层次逐步累积的变异对最终结果的影响。
研究结果
Figure 1. 自动化原位聚合SAX整体柱吸头用于固相萃取捕获（SPEC）蛋白质组学
通过扫描电子显微镜（scanning electron microscopy, SEM）证实，UV聚合后的整体柱完全填充吸头管腔，呈现典型的球状大孔形态，表明成功实现了吸头内的原位成型。
Figure 2. 设计空间映射与优化SAX整体柱配方的选择
通过绘制包含总单体浓度与METAC占比的二维设计空间，并结合背压测试和200 ng K562裂解液的鉴定性能筛选，确定了最优配方（27%总单体，38% METAC占单体体积）。主成分分析显示，低METAC组分（4-8%）与高METAC组分（32-38%）的蛋白质组强度谱显著分离，证明功能单体含量直接影响蛋白质捕获效率。
Figure 3. pSPEC血浆基准测试与重现性
与溶液内酶解相比，pSPEC在血浆中鉴定到的蛋白质组和母离子（precursors）数量分别增加约20%。按丰度三分位比较的中位变异系数（coefficient of variation, CV）显示，pSPEC在所有丰度区间均低于溶液内酶解，尤其在低丰度区域优势更明显。嵌套重现性设计的PCA分析表明，无论同一天还是不同天，不同变异层次（仅样品制备、吸头制造加样品制备、前驱液配制加吸头制造加样品制备）之间的欧氏距离均无显著差异，证实pSPEC平台的方差主要由最终的样品制备步骤贡献，而吸头制造和前驱液配制引入的额外方差极小。
总结与结论
本研究开发的pSPEC平台通过原位光聚合技术，成功将蛋白质组学样品制备中最关键的固定相组装步骤从手工操作转变为自动化、由配方定义的标准化过程。该平台不仅消除了手工装填带来的操作者间变异，还实现了384吸头/批次的规模化生产，且成本极低。研究结论明确指出：由于固定相床层现由单一优化配方原位聚合而成，相同的化学组成可在液体处理机器人上于数分钟内同时生产384个吸头。研究表明，pSPEC在血浆中的鉴定深度更高、忠实度更好且高度可重复，并且单一的化学配方和统一的操作规程可推广至多种生物体液，在尿液和唾液等稀释、缺乏充分研究的样品中达到了以往需要更繁琐工作流才能实现的深度。
