《Molecular & Cellular Proteomics》：High-throughput protein interactome identifies LSD1 as a regulator of SARS-CoV-2 production through lysine demethylation of viral nucleocapsid protein
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在生理条件下对蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interactions，PPIs）进行高通量鉴定与成像仍然是一项重大挑战。同时，SARS-CoV-2核衣壳（nucleocapsid，N）蛋白作为最丰富的病毒蛋白，在病毒产生
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在生理条件下对蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interactions，PPIs）进行高通量鉴定与成像仍然是一项重大挑战。同时，SARS-CoV-2核衣壳（nucleocapsid，N）蛋白作为最丰富的病毒蛋白，在病毒产生中发挥重要作用。为推进病毒机制研究并支持抗病毒药物开发，研究人员利用分裂的miRFP670nano3构建了迄今最亮且最小的近红外双分子荧光互补（near-infrared bimolecular fluorescence complementation，NIR-BiFC）系统。通过将该系统与下一代测序（next-generation sequencing，NGS）技术整合，研究人员建立了NIR-BiFC-Seq方法，用于蛋白质互作组的高通量图谱绘制。应用该方法，研究人员系统研究了SARS-CoV-2 N蛋白与宿主细胞蛋白之间的相互作用。研究结果表明，赖氨酸特异性去甲基化酶1（lysine-specific demethylase-1，LSD1）对N蛋白第233位赖氨酸（K233）进行去甲基化修饰，通过增强N蛋白的多种功能——包括N蛋白二聚化、与Nsp12的相互作用、病毒RNA结合以及液-液相分离（liquid-liquid phase separation，LLPS）——从而促进病毒产生。值得注意的是，靶向K233位点的抑制剂可显著抑制SARS-CoV-2的产生。该研究确立了NIR-BiFC-Seq作为一种灵敏的合成生物学平台用于互作组图谱绘制，并鉴定出LSD1介导的调控机制是抗病毒治疗的有前景靶点。
论文解读文章
一、研究背景与科学问题
蛋白质是生命体的基本功能分子，在病毒-宿主互作、细胞信号转导和基因表达调控等生理生化过程中发挥核心作用。在生理条件下高通量监测这些分子相互作用，对于理解潜在生物学机制至关重要。然而，现有蛋白质互作研究技术均存在显著局限性：酵母双杂交（yeast two-hybrid，Y2H）技术假阳性率高且局限于核内互作；亲和纯化-质谱联用（affinity purification coupled with mass spectrometry，AP-MS）难以捕获活细胞中的弱或瞬时互作且需要正交验证；酶催化邻近标记方法（如BioID、TurboID）依赖生物素连接酶催化，会破坏内源性生物素化平衡并产生细胞毒性。更重要的是，大多数现有方法必须考虑蛋白质互作组的时空分辨率，往往导致目标蛋白综合互作信息的丢失。因此，亟需一种兼具高特异性、非侵入性和全局捕获能力的高通量蛋白质互作图谱绘制技术。
SARS-CoV-2作为COVID-19的病原体，通过核衣壳（N）蛋白将基因组包装成核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP）复合物。N蛋白在感染期间大量表达，对病毒复制至关重要。冠状病毒N蛋白（包括SARS-CoV-2）与宿主因子相互作用以调节感染和致病过程，使其成为重要的治疗靶点。此前基于AP-MS或BioID-MS的研究报道了差异显著的N蛋白互作组，不同研究间重叠极低，这很可能是由于时空变异性所致。鉴于N蛋白的多方面功能，全面定义其细胞互作网络仍十分必要。
二、研究内容与总体结论
针对上述问题，研究人员开发了迄今最亮且最小的近红外双分子荧光互补（NIR-BiFC）系统——基于分裂的miRFP670nano3荧光蛋白。通过将该系统与下一代测序（NGS）技术整合，建立了NIR-BiFC-Seq方法，实现了在活细胞中直接进行蛋白质互作组的高通量图谱绘制。应用该方法，研究人员系统分析了SARS-CoV-2 N蛋白与人类全细胞蛋白质组的相互作用，鉴定出568个人类互作蛋白，其中86.97%（494个）为此前未报道的新型互作因子，揭示了此前未充分探索的细胞互作景观。进一步研究发现，宿主蛋白LSD1直接对N蛋白第233位赖氨酸（K233）进行去甲基化修饰，从而增强N蛋白的二聚化、与Nsp12的相互作用、病毒RNA结合以及液-液相分离（LLPS）等多种功能，共同促进病毒产生。靶向K233位点的抑制剂可显著抑制SARS-CoV-2的产生。该研究确立了NIR-BiFC-Seq作为灵敏且可扩展的生理互作组研究平台，揭示了LSD1介导的促进病毒产生的调控轴，并突出了抗病毒治疗的新靶点。
三、关键技术方法
研究人员主要采用了以下几项关键技术方法：一是基于分裂miRFP670nano3（在第107和108位氨基酸之间分裂）构建NIR-BiFC系统，该系统具有约17 kDa的小分子量和比现有最亮的IFP2.0-tBiFC系统高约4倍的荧光强度；二是将NIR-BiFC与NGS整合建立NIR-BiFC-Seq高通量筛选方法，将约15,000个人类开放阅读框（open reading frame，ORF）克隆文库（来自Beyotime公司甘油菌库）分为五个亚文库，通过Gateway重组构建慢病毒文库，以低感染复数（multiplicity of infection，MOI=0.3）感染稳定表达N-miR3C108-sfGFP的HEK 293T细胞，经3-5轮荧光激活细胞分选（fluorescence-activated cell sorting，FACS）富集后提取基因组DNA，PCR扩增整合的ORF并进行NGS测序鉴定；三是利用STRING数据库和Cytoscape软件构建分子互作网络，通过clusterProfiler包进行基因本体论（Gene Ontology，GO）分析，并与DrugBank数据库交叉比对鉴定可成药靶点；四是利用CRISPR-Cas9（LentiCRISPRv2系统）构建宿主因子敲除（knockout，KO）细胞系；五是采用免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，Co-IP）、免疫荧光（immunofluorescence，IF）、RNA免疫沉淀（RNA immunoprecipitation，RIP）、质谱分析、体外相分离实验和虚拟筛选等方法进行机制验证和抑制剂发现。
四、研究结果
NIR-BiFC-Seq的开发及SARS-CoV-2 N蛋白互作组鉴定。 研究人员选择miRFP670nano3作为骨架蛋白开发分裂NIR-FP系统，在107-108位点分裂产生miR3N107（1-107）和miR3C108（108-147）两个片段。将分裂片段分别融合到bJun和bFos互作对后，在HEK 293T细胞中共表达产生强BiFC信号，阴性对照无荧光。miRFP670nano3-BiFC在弱EGFP二聚化检测中信号比IFP2.0-tBiFC高3.77倍，在强bJun/bFos互作中高4.06倍，小鼠体内成像分别高3.81倍和13.78倍。利用NIR-BiFC-Seq鉴定出568个与SARS-CoV-2 N蛋白互作的人类蛋白，其中86.97%为新互作因子。GO分析显示显著富集于黏着斑、核糖体相关过程和细胞质翻译。STRING分析揭示了一个由802个节点和335条高置信度边组成的互作网络。通过互作组挖掘鉴定出25个可成药宿主靶点，关联203种FDA批准的抑制性化合物，其中乙酰唑胺（acetazolamide）和罗米地辛（romidepsin）等已在此前研究中显示出抗SARS-CoV-2活性。
基于互作组的实验筛选鉴定出adagrasib和acetazolamide为抗SARS-CoV-2药物。 研究人员评估了adagrasib（靶向KRAS）和acetazolamide（靶向CA2）的抗病毒活性。两种化合物均显著抑制SARS-CoV-2复制，且有效浓度下对细胞活力影响极小。
NIR-BiFC-Seq鉴定的细胞因子调控SARS-CoV-2产生。 研究人员通过BiFC实验确认了七个宿主蛋白（AK2、PRDX2、NXT1、GTF2F2、MTPN、TAF11和LSD1）与N蛋白的互作，并额外验证了九个蛋白（PPIA、YWHAB、HNRNPC、LMO4、RGS17、ARL6IP5、SRSF12、TIA1和HBP1）中的八个与N蛋白互作（HBP1除外）。利用LentiCRISPRv2系统在Caco-2细胞中分别敲除上述七个因子后，AK2、PRDX2、NXT1、GTF2F2或TAF11的敲除显著增加病毒产生，而MTPN或LSD1的敲除则显著抑制病毒产生。
LSD1通过去甲基化N蛋白第233位赖氨酸促进SARS-CoV-2产生。 研究人员通过IF和Co-IP实验确认了N蛋白与LSD1的物理互作。结构域定位实验表明，N蛋白的N-arm、LKR和C端结构域主要介导与LSD1的结合，而LSD1的1-172残基、SWIRM结构域和Tower结构域对其与N蛋白的互作至关重要。LSD1敲除显著降低N蛋白与病毒RNA的互作，而LSD1过表达显著增强病毒产生。质谱分析显示，LSD1敲除细胞中N蛋白LKR结构域的K233位点被甲基化，而野生型细胞中该位点为去甲基化状态。将K233突变为精氨酸（N(K233R)）后，病毒产生显著降低，且N蛋白与病毒RNA的互作明显受损。
LSD1促进N-N二聚化、N-Nsp12互作及N-病毒RNA的LLPS。 通过miRFP670nano3-BiFC实验，K233R突变显著损害N蛋白二聚化和与Nsp12的互作。体外液滴形成实验显示，野生型mEGFP-N与RNA的LLPS能力显著强于mEGFP-N(K233R)突变体。这些结果表明，LSD1介导的K233去甲基化通过增强N蛋白二聚化、Nsp12互作、病毒RNA结合和LLPS来促进SARS-CoV-2产生。
靶向N蛋白K233位点的抑制剂抑制SARS-CoV-2复制。 研究人员利用两种N蛋白模拟结构模型，对ZINC20数据库（包含9,297种DrugBank化合物）进行虚拟筛选，鉴定出两种高评分候选分子solamargine和hypericin。10 μM solamargine或3 μM hypericin处理可显著降低SARS-CoV-2复制，IC50值分别为1.70 μM和0.89 μM，且有效浓度下细胞毒性极小。
五、讨论与结论
在讨论部分，研究人员指出NIR-BiFC-Seq鉴定出的大量蛋白可能归因于使用了不受特定细胞系或时空条件限制的人类蛋白过表达文库，但需注意优化慢病毒文库的MOI以控制每个细胞的质粒拷贝数，且慢病毒过表达系统效率和分选严格程度可能影响最终鉴定结果——例如已确立的互作因子G3BP1/2在本系统中未被检测到。在新鉴定互作因子中，LSD1作为关键宿主因子支持病毒增殖，其通过直接结合N蛋白的N-arm、LKR和C端结构域并在K233位点去甲基化来发挥作用。此翻译后修饰对病毒适应性至关重要：K233去甲基化增强N蛋白二聚化、N-Nsp12互作和病毒RNA结合，而通过K233R突变或LSD1敲除破坏该修饰则显著损害SARS-CoV-2复制。研究还提出，LSD1是否通过稳定PRMT1发挥双重功能——既去甲基化K233又促进N蛋白R95和R177位点的甲基化——从而增强SARS-CoV-2产生，是一个值得未来研究的有趣问题。此外，GTF2F2和TAF11等互作因子被发现抑制SARS-CoV-2产生，可能与病毒蛋白竞争结合RNA聚合酶或病毒RNA有关，但确切机制有待进一步研究。
研究结论：该研究建立了NIR-BiFC-Seq作为生理互作组学研究的标志性工具，解码了LSD1驱动的对SARS-CoV-2发病机制至关重要的调控机制，靶向该调控轴为抑制病毒复制提供了有前景的策略。
