《Molecular Genetics and Metabolism》：Mass spectrometry measurements of glycosaminoglycans to assess disease-modifying treatments for the mucopolysaccharidoses: Methodological considerations
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粘多糖贮积症（mucopolysaccharidoses, MPS）是一类因糖胺聚糖（glycosaminoglycan, GAG）降解缺陷引起的罕见溶酶体疾病，导致进行性多系统损害。生物标志物测量对于评估疾病负担和治疗反应至关重要，尤其是随着新型酶替代疗法、
粘多糖贮积症（mucopolysaccharidoses, MPS）是一类因糖胺聚糖（glycosaminoglycan, GAG）降解缺陷引起的罕见溶酶体疾病，导致进行性多系统损害。生物标志物测量对于评估疾病负担和治疗反应至关重要，尤其是随着新型酶替代疗法、移植疗法、基因疗法及底物导向疗法的日益普及。液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS）已能够特异性地测量GAG衍生生物标志物；然而，不同方法学之间的分析测量物及其生物学解释存在显著差异。本综述考察了目前用于GAG测量的四种LC-MS/MS方法：内源性非还原端（non-reducing end, NRE）寡糖、酶促生成的内二糖、酶促NRE寡糖以及甲醇解衍生二糖。每种方法均提供GAG负荷的替代性或代表性测量，而非对完整或“总”GAG的直接测量。解聚化学、分析物特异性、校准、内标、色谱分离以及对结构异质性的敏感性等方面的差异会影响定量结果及其解释。特别是，报告为“总”硫酸乙酰肝素（heparan sulphate, HS）、硫酸皮肤素（dermatan sulphate, DS）、硫酸软骨素（chondroitin sulphate, CS）或硫酸角质素（keratan sulphate, KS）的测量值在不同方法和实验室之间可能包含不同分析物，不应假定其可互换。当GAG生物标志物在临床试验中用作药效学或替代终点时，这些考量尤为重要。需要适当的验证、方法特异性参考区间和临床决策限值、统一的命名法、认证参考物质、稳定同位素标记内标以及实验室间质量评估，以提高可比性。清晰识别实际测量物对于确保观察到的生物标志物变化被恰当地解释为治疗反应的证据至关重要。
粘多糖贮积症（MPS）是一类因糖胺聚糖（GAG）降解酶缺陷引起的罕见溶酶体贮积症，导致GAG在溶酶体内蓄积，引发进行性多系统损害。随着酶替代疗法（ERT）、造血干细胞移植（HSCT）及基因治疗等疾病修饰疗法的不断发展，生物标志物在评估疾病负担和治疗反应中发挥核心作用。传统总尿GAG测定虽有一定价值，但缺乏特异性。液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）能够特异性定量GAG衍生生物标志物，但不同方法所测量的分析物及其生物学解释差异显著，这给临床试验中生物标志物的解读带来挑战。为此，研究人员对目前应用的四种LC-MS/MS方法进行了系统综述，旨在厘清各方法的分析物本质，评估其优缺点，并强调方法学标准化的必要性。
研究人员通过回顾已有文献和自身研究数据，分析了四种方法，得出它们均是GAG负荷的替代测定，而非对完整或“总”GAG的直接测量；不同方法报告的“总HS”“总DS”等术语可能对应不同分析物，不能跨方法或实验室互换。该综述的意义在于为正确选择和应用GAG生物标志物提供框架，尤其是在新疗法临床试验中作为药效学或替代终点时，避免误导性解读。
关键技术方法方面，四种方法包括：①内源性非还原端（NRE）方法，直接测量MPS患者体液中天然存在的NRE寡糖，无需体外解聚，已用于尿液、干血斑、血浆/血清及脑脊液，覆盖多种MPS亚型；②酶促内二糖方法，利用细菌裂解酶（肝素酶、软骨素酶ABC、角质素酶II等）将GAG解聚为不饱和二糖，通过LC-MS/MS定量，用于估算HS、CS/DS和KS水平；③酶促NRE方法（Sensi-Pro），结合酶解与还原胺化同位素标记，同时测量疾病特异性NRE寡糖和内部二糖，适用于MPS I、II、IIIA-D、IVA、VI和VII；④甲醇解法，在酸性甲醇中水解GAG生成甲基糖苷二糖，使用氘代甲醇产生同位素标记内标。样本队列包括MPS各亚型患者的尿、脑脊液、干血斑等，以及MPS动物模型。
研究结果部分，按各方法分述：
3.1 内源性NRE方法：该方法的依据是MPS中酶缺陷导致特定NRE寡糖蓄积。通过1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）衍生化，LC-MS/MS可同时测量多种大小的寡糖。研究表明，该方法对MPS诊断具有100%的敏感性和特异性（除无尿液样本的MPS IX和X），且无年龄依赖性。在治疗监测中，ERT后尿液NRE生物标志物急剧下降；在MPS IIIA基因治疗临床试验中，CSF NRE生物标志物下降达65%，并伴随认知改善。局限性包括部分结构归属未定、单一NRE标志物可能仅反映一种GAG（如MPS I/II中HS而非DS），且缺乏稳定同位素内标，通常只能相对定量。
3.2 酶促内二糖方法：该方法利用酶解将GAG转为二糖，是应用最广的方法。使用肝素酶I/II/III、软骨素酶ABC及角质素酶II分别处理HS、CS/DS和KS。由于β-消除反应产生不饱和ΔUA，无法区分GlcA/IdoA来源，且不同酶的特异性影响DS和CS的区分。研究显示，CSF中HS二糖测量已用于多项临床试验，如鞘内艾杜糖苷酶使CSF HS降低30.6%但未达认知终点；tividenofusp alfa使CSF HS降低约91%；RGX-121基因治疗以二糖D2S6作为替代终点。局限性包括消化效率不一致、同分异构二糖干扰、以及“总HS”定义在不同研究中不一致，导致结果不可比。
3.3 酶促NRE方法：该方法通过裂解酶引入不饱和键，使内部二糖与NRE片段相差18 Da，从而特异识别NRE寡糖。结合同位素标记标准品（Sensi-Pro），已用于MPS诊断和亚型鉴定。在MPS I患者中，HCT后尿HS和NRE寡糖下降；接受鞘内laronidase治疗的患者CSF NRE下降>80%，且下降幅度与移植后2年神经认知改善相关。该方法需要酶解和标记步骤，回收率和消化效率可能影响定量，且“总HS”定义为D0A0+D0S0，与其他方法不同。
3.4 甲醇解方法：该方法使用甲醇/HCl在高温下水解GAG产生甲基糖苷二糖。通过氘代甲醇合成同位素标记内标，采用同位素稀释定量。CS和DS产物为同分异构体，需要色谱分离。研究显示，在MPS I移植患者CSF中DS和HS下降；MPS II小鼠模型中脑HS随治疗下降，且CSF HS与脑HS相关；MPS VII的vestronidase alfa临床试验使用尿GAG甲醇解产物作为终点。但校准物为商品化GAG聚合物，与内源性人GAG结构不完全一致，定量准确性依赖于假设。
4. 解释和报告部分指出，所有方法均为替代测量，结果应视为方法特异，不能跨平台互换。建议建立方法特异参考区间和临床决策限值，考虑低限效应。校准和IS策略各有不足，需使用认证参考物质（CRM）和稳定同位素标记内标。分析前因素如尿液肌酐归一化、CSF血液污染和采集体积、干血斑红细胞压积等均需考虑。实验室应遵循ISO 15189、CLIA/CAP、ICH M10及FDA指南进行验证。
5. 未来方向强调开发CRM和稳定同位素标记内标，尤其是内源性NRE方法已有MPS IIIA、I和II的合成标准。通过统一命名、标准化方案和实验室间质量评估可实现结果可比性。
结论部分，研究人员认为，所有GAG质谱测量方法均为替代指标，不能直接测定完整或“总”GAG；不同方法间的结果不应互换。提高方法可比性需要明确实际测量物、适当验证、方法特异性参考区间、CRM和稳定的同位素内标，以及实验室间质量评估。只有清晰识别测量物，才能确保观察到的生物标志物变化被正确解读为治疗反应的证据。
