基于非对称流场流分离（AF4）的纳米沉淀组成异质性解析：脂质组成与表面活性剂分配对颗粒形成的影响

《Nano Today》：Compositional variation insights into nanoprecipitation through Asymmetric flow field-flow fractionation (AF4): Impact of lipid composition and surfactant placement on particle formation

　　

脂质纳米颗粒（lipid nanoparticles, LNPs）是有吸引力的药物递送平台，但传统批式表征的一个根本局限在于其无法解析纳米沉淀过程中多分散粒径分布下的组成异质性。在此，研究人员系统考察了两个关键处方参数——表面活性剂分配（surfactant placement）与固/液脂质组成（solid/liquid lipid composition）——对颗粒形成的影响，尤其关注纳米颗粒内物理包封的尺寸分布与分配。模型体系为包载F?rster共振能量转移（F?rster resonance energy transfer, FRET）供体-受体荧光团对的LNPs（FLNPs），用于探测纳米尺度载荷分布。将批式表征（动态光散射（dynamic light scattering, DLS）、透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）和光物理分析）、流动诱导分散分析（flow-induced dispersion analysis, FIDA）与非对称流场流分离（asymmetrical flow field-flow fractionation, AF4）联用多角度光散射（multi-angle light scattering, MALS）、DLS、UV–vis和荧光检测相结合，结果显示表面活性剂分配是主导参数：当表面活性剂溶于有机相时，产生尺寸较小、形状多变且为单供体FLNPs的颗粒；当表面活性剂溶于水相时，则形成较大、更球形且共定位的颗粒。液体脂质的加入使尺寸分布向更高的尺寸均一性移动。这些发现将纳米沉淀参数与尺寸分布及组分定位联系起来，凸显了AF4解析异质性的能力，并为控制LNPs尺寸和载荷分布提供设计原则。

研究背景与问题：脂质纳米颗粒（LNPs）已被广泛研究作为治疗、诊断和化妆品用活性纳米载体，其生物相容性、携带疏水化合物及保护包封活性成分避免过早降解的能力使其成为有吸引力的递送平台；其纳米尺寸有利于穿透皮肤角质层、细胞膜等生物屏障，并可递送DNA、RNA和蛋白质等生物分子。纳米沉淀是制备LNPs最简单的方法之一，涉及有机相与水相反溶剂快速混合，引发过饱和、成核、生长、聚结和稳定化。然而，脂质组成和表面活性剂分配如何影响纳米颗粒尺寸分布及分子货物分配仍不清楚，尤其物理包封物种在不同尺寸亚群中是否均匀分布鲜有研究；该问题影响处方稳健性，并可能直接影响药代动力学、细胞摄取、疗效和安全性。传统批式表征难以解析跨粒径的组成差异。非对称流场流分离（asymmetrical flow field-flow fractionation, AF4，一种按流体动力学尺寸分离纳米颗粒的场流分离技术）可在宽尺寸范围内高分辨分离纳米颗粒，分离基于流体动力学直径，保留时间与流体动力学扩散系数相关并与粒径直接相关。已有少数AF4研究用于LNPs结构与组成分析，但未显示载荷分子是否在粒径亚群中均匀分配；其他相关研究考察核酸包封LNPs的内部形态或组分相关性，但未涉及液体脂质或表面活性剂分配对组分分布及粒径异质性的影响，尤其在包封疏水化合物的LNPs处方中。固/液脂质比常被用于平衡包封效率与批式粒径分布，液体脂质可改变固体脂质的有序结构并随比例增加形成油相纳米隔室，从而改变载荷含量和释放动力学，但不同研究对其粒径影响报道不一致，且未涉及纳米沉淀过程中跨尺寸亚群的组分分配。表面活性剂是决定最终粒径和促进稳定的关键因素，通过吸附于疏水表面降低界面张力并提供空间或静电稳定；多数沉淀研究将表面活性剂预溶于水相，少数将其置于有机相，其相关意义尚未充分探索。基于此，研究人员制备共包封两种疏水荧光团的双荧光脂质纳米颗粒（dual FLNPs），作为F?rster共振能量转移（FRET）对模型体系，系统研究固/液脂质比和表面活性剂分配对颗粒形成、尺寸异质性、形状和组分定位的影响。该论文发表于《Nano Today》。研究结论表明，表面活性剂分配是控制粒径、形状和荧光团分配的主导因素；表面活性剂位于有机相时更早到达新生核，可能阻止颗粒生长，形成较小且形状多变的颗粒，而水相表面活性剂导致吸附延迟、生长延长和结构重组，形成较大且更球形颗粒；液体脂质增加使粒径分布由双峰向更单峰、更均匀转变；供体和受体荧光团并非在各尺寸分级中均匀共定位。该研究凸显AF4解析多分散、物理包封纳米颗粒亚群行为的能力，并为调控LNPs尺寸和载荷分布提供设计原则。

关键技术与方法（≤250字）：研究人员以双荧光脂质纳米颗粒（FLNPs）为模型，通过纳米沉淀制备不同Tricaprin/L1349质量比（10:0、9:1、5:5、1:9）及表面活性剂Poloxamer-407分别位于水相（org-Aq(S)）或有机相（org(S)-Aq）的处方；关键技术包括批式动态光散射（DLS）、透射电子显微镜（TEM）、流动诱导分散分析（FIDA，基于Taylor分散估计荧光标记颗粒流体动力学半径的技术）、AF4在线联用多角度光散射（MALS）、DLS、UV–vis和荧光检测（AF4-MALS-DLS-UV-FLD），以及批式吸收光谱、稳态荧光和FRET分析。无样本队列来源。

研究结果：
Particles size distribution and shape analysis：批式DLS显示，org-Aq(S)方法制备的双荧光处方均具有较org(S)-Aq更大的流体动力学平均半径，多分散指数（PDI）总体相近，仅9:1 org(S)-Aq处方PDI较高；所有处方在批式DLS中呈单峰分布。AF4-MALS-DLS解析显示，10:0、9:1和5:5 org-Aq(S)处方存在两个颗粒群体，呈双峰分布，1:9处方转为单峰；org(S)-Aq系列10:0、9:1和5:5主峰对应较小颗粒，并伴随向较大R_g延伸的宽尾，1:9转为单峰。批式DLS受瑞利散射强调大颗粒，而AF4-MALS-DLS揭示更细的粒径分布差异，说明增加液体脂质比例使整体粒径分布更均一。TEM结果与批式DLS和AF4一致，org-Aq(S)制得颗粒较大；org(S)-Aq系列可见不规则形状，1:9处方可见聚集。FIDA显示10:0、1:9 org-Aq(S)及10:0 org(S)-Aq的平均R_h约16 nm，1:9 org(S)-Aq约24 nm；10:0处方分布较宽，1:9分布较窄。形状因子ρ=R_g/R_h显示，9:1、5:5、1:9 org-Aq(S)的ρ接近0.77，支持较紧凑硬球形状，10:0 org-Aq(S)约0.8；org(S)-Aq系列ρ变异性更大，提示形状或内部结构异质性。

Component distribution：采用AF4-MALS-UV-FLD，以350 nm紫外信号（UV₃₅₀）按累积分布划分D₀-D₉、D₁₀-D₄₉、D₅₀-D₈₉、D₉₀-D₁₀₀四个分级。10:0 org-Aq(S)主群体位于R_g约29 nm，另见约21 nm次群体；随液体脂质增加，小群体贡献降低，5:5和1:9转为单峰。org(S)-Aq系列10:0、9:1和5:5主峰约20、21、21 nm，肩峰约31、30、32 nm且相对强度递增，1:9转为约25 nm单峰。org(S)-Aq方法的R_g范围整体小于org-Aq(S)，且随液体脂质增加粒径谱略向较大半径移动。供体和受体荧光团总体优先定位于较小颗粒；1:9 org-Aq(S)中相当部分供体出现在较大群体；受体约70%持续位于D₀-D₄₉。9:1 org(S)-Aq中供体主要位于D₁₀-D₄₉，约一半受体位于D₅₀-D₈₉。结果表明载荷分布异质，供体和受体在各分级中并未按比例共定位。

Photophysical implications and FRET behavior：AF4-UV-FLD的FRET比值分析显示，org-Aq(S)方法中随液体脂质加入，FRET比值总体维持在约0.6，仅在10:0的D₉₀-D₁₀₀及1:9较大分级中降至约0.4；10:0的D₉₀-D₁₀₀尽管供体和受体水平相当，FRET最低；D₀-D₉和D₁₀-D₄₉中共分布导致有效能量转移，1:9的D₅₀-D₈₉中供体过量导致转移效率降低。org(S)-Aq方法中，10:0和9:1在D₀-D₉具高FRET，D₁₀-D₄₉下降，D₅₀-D₁₀₀因受体丰度较高且供受体较平衡而回升；5:5和1:9分布更平衡且FRET效率增加。能量转移差异主要源于组分分布不匹配及密集荧光团区域中的荧光猝灭。

Batch photophysical correlation：批式吸收光谱显示供体和受体吸收带分别约492 nm和553 nm；org(S)-Aq处方在492 nm吸收略强于553 nm，org-Aq(S)趋势相反；org(S)-Aq在505 nm和570 nm的荧光发射更强，表明发射猝灭降低。所有双荧光处方的吸收峰相对荧光团溶液无明显蓝移，但受体带520/553 nm峰强比高于供体带465/492 nm，提示受体荧光团H-聚集（H-aggregation）程度更高；DiO和DiI均带 bulky 四苯硼酸根（tetraphenylborate, TPB）反离子，虽可空间隔离荧光团并减少范德华接触，但部分π-π堆叠仍发生，受体堆叠更强，早期成核中的堆叠驱动受体聚集，随后表面活性剂吸附可解释受体优先富集于较小分级。FRET效率在相同表面活性剂分配下受液体脂质影响不同，但org-Aq(S)总体高于org(S)-Aq；org(S)-Aq较低FRET提示供体到受体转移效率不足，可能形成单供体FLNPs（single-donor FLNPs）而非FRET对FLNPs，并解释其荧光猝灭降低。

Proposed formation model inferred from final-state particle structure and composition：基于最终粒径、形貌、荧光和尺寸分辨组成数据，研究人员提出形成模型：纳米沉淀中有机相与水相互扩散使局部溶质浓度迅速升高至临界成核浓度，荧光分子先聚集并从溶液耗尽，随后被表面活性剂吸附固定，较大部分供体和受体被截留于较小群体，剩余溶质继续扩散并整合入生长颗粒。水相表面活性剂需先扩散至疏水表面，延迟期间可形成新核并由扩散控制生长，产生较大且更异质颗粒；有机相表面活性剂更快到达疏水界面，快速阻滞具有较强分子间相互作用的荧光团，早期覆盖可阻碍进一步溶质整合但未完全终止生长，溶质继续沉积和重组直至完全覆盖，终止生长，形成较小颗粒；该中断生长过程在结构平衡前停止，可解释不规则形状。液体脂质通过引入无定形相延迟固体脂质固化，增加溶质聚集时间窗，使供体分布更宽并向较大群体移动，受体向较小群体移动，并导致供受体分布错配；无液体脂质时，溶质聚集与表面活性剂吸附的竞争是决定共包封的关键变量。批式光物理中org(S)-Aq具有更高总体荧光发射和供体相关吸收但较低批式FRET，结合受体聚集程度相当，提示供体行为差异及部分单供体FLNPs形成；快速表面活性剂到达疏水表面停止溶质沉积和聚结，可形成单组分FLNPs，减少共定位供受体并降低自猝灭。直接时间分辨表征早期成核和生长为未来工作，本研究旨在建立最终LNP异质性的尺寸分辨分析框架。

讨论与结论：讨论部分将上述结果归因于表面活性剂到达疏水核的时间、溶质聚集与表面活性剂吸附的竞争，以及液体脂质对固体脂质固化动力学和分子迁移率的调节；这些因素共同决定最终粒径、形状、供受体分配、FRET效率和猝灭行为。研究结论部分翻译如下：本研究利用双荧光脂质纳米颗粒（dual FLNPs），通过批式DLS、TEM图像、FIDA、高分辨AF4-MALS-DLS-UV-FLD及批式光物理测量的综合整合，揭示脂质组成和表面活性剂分配如何影响纳米沉淀过程中的纳米颗粒形成、尺寸异质性、形状和组分分配。研究人员解析了粒径谱中的亚群，并对每一分级中供体和受体荧光团的分布进行了半定量。在所有处方中，表面活性剂分配是控制粒径、形状和荧光团分配的主导因素。表面活性剂预溶于有机相时更迅速到达新生核，可能在结构平衡前终止颗粒生长，形成较小且形状多变的颗粒；相反，表面活性剂位于水相导致吸附延迟、生长延长和结构重组，形成较大且更球形的颗粒，批式DLS、TEM和AF4-MALS-DLS分析均支持这一点。组分分布分析显示供体和受体荧光团在各尺寸分级中并非均匀共定位。在org-Aq(S)方法中，由于更强的π-π堆叠和成核阶段更早聚集，供体和受体荧光团均优先富集于较小分级，而液体脂质加入使供体荧光团分布更宽。聚集与表面活性剂吸附之间的竞争似乎影响供体和受体荧光团是共包封（形成FRET对LNPs）还是分离（形成单供体或猝灭物种）。此外，增加液体脂质比例使群体分布从双峰转向更单峰，表明液体脂质加入通过减缓成核和促进扩散调节这种竞争，导致更均匀但结构有序性更低的FLNPs。这些机制模式进一步得到批式光物理表征支持，显示荧光强度、聚集状态和FRET效率的处方依赖性差异。对于其他LNP处方，这种特定FRET对可能需要由载荷特异的光学或化学读出替代；尽管如此，本工作的核心贡献是证明尺寸分辨分析能够揭示传统体相测量中掩盖的处方依赖性载荷分配。总之，这些发现为固/液脂质比和表面活性剂分配如何共同影响纳米沉淀过程并决定粒径分布、形状和纳米尺度组分定位提供了见解。一方面，本工作凸显AF4在解析多分散、物理包封纳米颗粒和揭示亚群行为方面的强大能力；另一方面，所得见解为调节包封均一性和推进基于LNP递送系统的理性设计提供实用策略。